La metformina riduce il tasso di recidiva nei pazienti con leucemia linfoblastica acuta da precursore delle cellule B (Ph+ negativo)

I geni MDR (Multidrug-Resistance) sono implicati nella resistenza di diversi tipi di cancro. I più importanti sulla leucemia sono ABCB1 e ABCG2- ABCB1 è implicato sulla resistenza e sulla gravità nella leucemia mieloide acuta e nella leucemia linfoblastica acuta pediatrica. Quei trasportatori usano l'ATP per l'uso. La metformina riduce la riserva intracellulare di ATP (adenosina trifosfato) mediante l'attivazione di AMPK. Recentemente sulla linea cellulare di cancro MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, linea cellulare di cancro al seno), la metformina blocca la funzione della glicoproteina P mediante l'inibizione del fattore nucleare -kappa-B.

Le evidenze cliniche in questo momento sono limitate, basate su piccoli studi clinici o studi osservazionali. Questo studio cerca di valutare l'effetto dell'aggiunta di metformina a un regime chemioterapico standard su pazienti che esprimono alti livelli di espressione di mRNA (acido ribonucleico messaggero) ABCB1

Protocollo sperimentale

I pazienti saranno stratificati in tre gruppi: L'alta espressione, bassa espressione e assente espressione genica secondo il livello di mRNA di ABCB1 alla diagnosi. I campioni sono ottenuti da cellule del sangue periferico mononucleate

Estrazione dell'RNA totale L'RNA totale è stato isolato mediante TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) secondo le raccomandazioni del produttore descritte da Chomczynski e Sacchi.

La concentrazione e la purezza dell'RNA totale è stata determinata in uno spettrofotometro UV-vis (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). L'integrità del materiale genetico è stata confermata dall'elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% a 70 V per 40 min. L'RNA è stato conservato a -80°C fino al momento dell'uso.

Sintesi del cDNA Per la sintesi del c DNA (acido desossiribonucleico complementare) la quantità di RNA utilizzata è stata di 2 µg per un volume finale di 20 µg. L'RNA è stato miscelato con 1 pi di oligonucleotide 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) e 1 pi di dNTPs (deossinucleoside trifosfato) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Dopo l'aggiunta di 4 µl di Tampone 5 X (Tris-HCl (acido cloridrico) 250mM, KCl (cloruro di potassio) 375 mM MgCl2 15mM), 2 µl di DTT (ditiotreitolo) (0.1M) e acqua, tutta la miscela è stata incubata a 37° per due minuti e 1 µl di MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) Reverse transcriptase-enzyme (200u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) e incubato a 37°C per 50 minuti.

Analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) I livelli di espressione dell'mRNA dei geni ABCB1 (Hs01069047) e della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; Hs00985689) sono stati misurati utilizzando il test di espressione genica TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , California, Stati Uniti). Il gene GAPDH è stato utilizzato come controllo endogeno e ciascun campione è stato analizzato in triplicato. I livelli di espressione relativi sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt con il midollo osseo come calibratore. I punti di cut-off di espressione alta e bassa sono stati determinati dai valori medi osservati nei donatori sani.

Protocollo di trattamento Tutti i pazienti ricevono un trattamento di remissione dell'induzione con una fase iniziale di pre-induzione con steroidi (prednisone) dal giorno -7 al giorno -1 (-7 ,-6 = 25mg , -5 , -4 : 50mg , -3, -2: 75 mg e il giorno -1: 100 mg). Il trattamento di induzione della remissione si basa su un trattamento di 28 giorni con prednisone (60 mg/m2), vincristina (1,5 mg/m2 massimo 2 mg) e daunorubicina 60 mg/m2 nei giorni +1, +8 e +15. Se il paziente archivia una Remissione Completa, continua con una terapia di consolidamento con blocchi sequenziali di trattamento che include Citarabina, Etoposide, Metotrexato. Se il paziente è ancora in remissione al termine della terapia di consolidamento continua la fase di mantenimento che comprende 6-mercaptopurina e una dose settimanale di metotrexato per circa due anni

Risposta Al giorno 28 del trattamento di induzione della remissione, in base al risultato del campione di midollo osseo, i pazienti saranno dichiarati in remissione (meno del 5% di blasti) o refrattari (>5% di blasti). Se il paziente presenta in qualsiasi momento del trattamento un aumento della conta dei blasti midollari, il paziente è considerato in recidiva.