Efecto de la terapia de ondas de choque sin análisis biológico e inmunohistoquímico. (ESWT)

Procedimientos ESWT Los participantes recibieron siete sesiones de terapia ESWT dos veces por semana, siendo la última sesión unos veinte minutos antes del procedimiento quirúrgico de cirugía bariátrica, la terapia se realizó en un área de 150 cm² en el lado izquierdo de la región abdominal, siguiendo el blanco línea, frecuentemente 15Hz, con 4.000.000 disparos con energía de 180mJ y punta de acero inoxidable de 15mm y 2.000.000 disparos con energía de 100mJ con punta de plástico de 15mm, para el tip slip se utilizó una Loción Industrial Cosmética Esencial Thork ® LTDA- MED Anvisa nº 25351.419510 / 2017-95.

Para la terapia se utilizó el equipo THORK Shock Wave® - IBRAMED- Industria Brasileira de Equipamentos Electromédicos EIRELI, aprobado por Anvisa nº 10360310036.

El lado directo del abdomen de los participantes se usó como control y no recibió terapia ESWT.

Procedimiento quirúrgico

Luego de realizar el procedimiento anestésico al inicio del acto quirúrgico de cirugía bariátrica, el cirujano responsable extrajo dos fragmentos de tejido cutáneo con un tamaño promedio de 4 cm de diámetro, una muestra de la región previamente delimitada en el lado izquierdo del abdomen y la otra muestra del lado contralateral donde no hubo demarcación considerada como control.

Procedimiento histológico Después de la recolección, el material se almacenó en un recipiente con formaldehído al 10% durante 48 horas. Las muestras se procesaron histotécnicamente, se incluyeron en parafina y luego se cortaron con un micrótomo rotatorio en secciones de 3-5 μm de espesor.

Para la evaluación morfológica del tejido cutáneo y las células de colágeno, los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y tricrómico de Masson (ab150686, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Los portaobjetos se evaluaron mediante microscopía óptica con microscopio binocular (Nikon YS 100, Japón) adaptado con ocular WSCF 10X/18 y lentes Nikon 4X/0.10, 10X/0.25, 40X/0.65 y 100X/1, 25.

Para diferenciar los tipos de fibras de colágeno se utilizó la tinción con Picrosirius Red (ab150681, Abcam). Después de la tinción, los portaobjetos se analizaron bajo luz polarizada con un microscopio DMR (Leica) y se tomaron fotografías a 400 aumentos, las fibras de colágeno se diferenciaron mediante su tinción y las fibras de colágeno tipo I fueron de color amarillo-naranja. algunos casos incluso rojo y tipo III con coloración verde, para cuantificar los análisis se utilizó el software ImageJ® (NIH, Bethesda, EE. UU.).

Todas las preparaciones fueron realizadas siguiendo el protocolo de anticuerpos y estandarizado por el laboratorio de análisis patológico del Hospital de Clínicas da Unicamp.

Procedimientos inmunohistoquímicos Para realizar las reacciones inmunohistoquímicas, los bloques de parafina con las muestras de piel se cortaron a un espesor de 3 μm y se colocaron en portaobjetos firmados (3-aminopropil-trietoxisilano, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Se realizaron controles positivos y negativos en todas las reacciones. Las reacciones se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos previamente publicados.

Brevemente, los tejidos fueron sometidos a procesos de desparafinado, rehidratación y bloqueo de peroxidasa endógena. La recuperación antigénica se realizó con una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH 9,0, en una olla a presión eléctrica durante 15 minutos.

Para el análisis inmunohistoquímico se utilizaron los siguientes anticuerpos, marcadores de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y sus respectivos receptores: FGF1 (Antibody sc-55520, Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.), FGF2 (Antibody sc-365106, Santa Cruz Biotechnology), FGFR1 (Antibody sc-121, Santa Cruz Biotechnology), FGFR2 (Antibody sc-122, Santa Cruz Biotechnology) y para evaluar la proliferación celular se utilizó el marcador Ki67 (Antibody ab92742, Abcam).

La reacción antígeno-anticuerpo se desarrolló utilizando el sustrato cromogénico (3.3 diaminobencidina-DAB, Sigma-Aldrich). Luego, las diapositivas fueron escaneadas y analizadas digitalmente también de acuerdo con los protocolos anteriores.