Biomarqueurs sanguins épitranscriptomiques pour la maladie coronarienne - Une étude de cohorte prospective (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Contexte - Cardiopathie ischémique

Avec une prévalence mondiale de 126,5 millions de personnes et une mortalité annuelle de 8,9 millions, la cardiopathie ischémique (CI) est la principale cause de décès (GBD Collaborators 2017). L'IHD se développe à la suite d'une athérogenèse en cours, un processus d'accumulation de lipides dans les parois des artères coronaires. Finalement, l'accumulation de cholestérol et de calcium forme des dépôts, c'est-à-dire des plaques, qui rétrécissent la lumière des vaisseaux. Au début de l'infarctus du myocarde (IM), une telle plaque se rompt, ce qui conduit à la mort anoxique du myocarde en s'appuyant sur l'apport sanguin du vaisseau. À court terme, la fonction cardiaque est sauvée par la formation d'une cicatrice raide. Au fil du temps, la fonction de pompage se détériore généralement avec une insuffisance cardiaque (IC) qui s'ensuit.

De manière optimale, les biomarqueurs de la maladie sont analysés à partir du sang et fournissent à la fois un aperçu de la progression et de la gravité de la maladie et facilitent l'évaluation de l'efficacité du traitement. Malheureusement, les biomarqueurs optimaux pour l'IHD n'ont pas été identifiés à ce jour. Le nombre important mais incalculable de personnes vivant avec une cardiopathie ischémique non diagnostiquée, bénéficiant d'un diagnostic précoce, souligne la nécessité d'un biomarqueur de la cardiopathie ischémique.

Contexte - Epitranscriptomique

L'épitranscriptomique, le domaine des modifications post-transcriptionnelles de l'ARN, analogue à l'épigénétique de l'ADN, a récemment gagné en notoriété scientifique (Saletore 2012). Ce domaine en expansion découvre une nouvelle couche de régulation biologique qui contrôle des processus allant de la prolifération cellulaire à la mort.

Bien que plus de 170 modifications d'ARN aient été identifiées dans des espèces d'ARN (Yang 2018), la méthylation de l'adénosine en position azote-6 (m6A) se distingue comme l'une des plus courantes et des plus étudiées (Liu 2020). Suite aux découvertes initiales des ARNm méthylés de m6A dans les années 1970 (Desrosiers 1974), l'épitranscriptomique n'a recommencé qu'au cours de la dernière décennie avec le développement de méthodes in vivo fiables pour évaluer m6A (Dominissini 2012). Ces méthodologies précoces basées sur l'immunoprécipitation (c. meRIP-seq) a facilité la découverte des modèles de ponctuation m6A spécifiques et des écrivains spécifiquement désignés (méthyltransférases ; complexe METTL3/14/WTAP1 et METTL16), des lecteurs (protéines de liaison ; par ex. famille des protéines YTH) et gommes (déméthylases ; ALKBH5 ; Zaccara 2019).

Plusieurs lecteurs médiant les effets m6A de la famille de domaines YTH ont été identifiés. YTHDF1-3 favorise la traduction, la dégradation ou les deux de l'ARNm, respectivement. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 et les ribosomes reconnaissent également m6A et favorisent la traduction et la compartimentation cytoplasmique (Zaccara 2019).

Des changements dans les niveaux de m6A ont été associés à de nombreuses pathologies, notamment des cancers, des troubles cardiovasculaires et neurologiques (Frye 2016). Des études utilisant à la fois l'inactivation et la surexpression des écrivains et effaceurs m6A ont révélé leur rôle dans la conduite de la réactivité immunitaire, de la prolifération cellulaire, de la migration et de l'apoptose (Delaunay 2019).

Contexte - Epitranscriptomique & coeur

Un ensemble d'études récemment publiées suggère un rôle à la fois pour l'édition m6A et A-to-I (adénosine-inosine, une autre modification courante diversifiant le transcriptome en modifiant l'appariement des bases) pendant l'hypertension (Jain 2018), la néovascularisation (Kwast 2019) , hypertrophie myocardique (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ischémie (Mathiyalagan 2019) et IC (Berulava 2020). Alors qu'un ensemble de preuves indiquent que l'épitranscriptomique contribue à la santé et aux maladies cardiaques, toutes les études initiales se sont concentrées sur le myocarde.

Justification, objectifs et signification

Nous émettons l'hypothèse que la physiopathologie de l'IHD se reflète dans l'épitranscriptome de l'ARN circulant. Par exemple, l'ARN ribosomique a une longue demi-vie et ses modifications dans la circulation coronarienne peuvent répondre à l'état du cœur.

Les objectifs du projet IHD-ERPITRAN sont : (1) d'établir des protocoles de criblage pour les biomarqueurs épitranscriptomiques, (2) de fournir un aperçu épitranscriptomique de la physiopathologie de l'IHD, (3) d'identifier un ensemble de candidats biomarqueurs IHD et (4) d'ouvrir des voies de recherche thérapeutique développement qui étaient auparavant ignorés en raison du manque de recherche et des limites méthodologiques. Par exemple, notre groupe de recherche a rapporté une découverte de ligands à petites molécules pour les ARN méthyltransférases (Selberg 2019).

Puisqu'il a été suggéré que l'épitranscriptomique joue un rôle régulateur dans le cœur et que l'IHD-EPITRAN est parmi les premiers à évaluer les biomarqueurs sanguins épitranscriptomiques dans l'IHD, le projet détient les clés d'une percée scientifique avec des avantages cliniques mondiaux attendus.

Méthodes

Cohortes d'étude - 200 patients sont recrutés en quatre cohortes, comptant 50 patients chacune. La première cohorte est constituée de patients se présentant à l'unité cardiaque avec un IM aigu revascularisé par intervention coronarienne percutanée (ICP), une cohorte qui donne un aperçu précieux de la façon dont le phénotype aigu de l'IHD se reflète dans les épitranscriptomes sanguins. Deuxièmement, la cohorte d'étude principale du projet sera formée de patients présentant un phénotype IHD stable traité par pontage aortocoronarien (CABG) et offre des informations essentielles en ce qui concerne l'ischémie chronique et l'athérogenèse coronarienne, deux processus en cours dans le silence, c'est-à-dire non diagnostiqués, IHD. Troisièmement, les patients destinés à une thérapie de remplacement valvulaire aortique (RVA) en raison d'une sténose sans IHD fournissent au groupe témoin positif une pathologie cardiaque différente, et, quatrièmement, avec les patients sains non IHD vérifiés avec la tomodensitométrie coronarienne (CT ), forment les cohortes témoins du projet.

Échantillons d'étude - L'IHD-EPITRAN découvre les épitranscriptomes d'ARN cellulaire et acellulaire du sang à partir des échantillons de sang TEMPUS(TM) et EDTA prélevés deux fois, respectivement. De plus, pour les cohortes MI et CABG, les épitranscriptomes des échantillons de tissu de l'appendice auriculaire droit sont déchiffrés pour un point de référence. Enfin, un ensemble de biomarqueurs supplémentaires HF et IHD : NT-proBNP, hsCRP, sST2 et TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 et Tibaut 2019) sont mesurés.

Méthodes d'ARN - L'isolement et le fractionnement de l'ARN avec des méthodes validées en laboratoire sont suivis de l'analyse quantitative de sept modifications de base à l'aide d'un système UHPLC-chromatographie liquide quadripolaire triple-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Suite à l'analyse quantitative, une présélection d'ARN à base d'anticorps anti-m6A riche en marques m6A en tandem avec le séquençage, c'est-à-dire meRIP-seq, est effectuée. Enfin, après l'UHPLC-LC-MS/MS et le meRIP-seq, un séquençage direct à lecture longue des nanopores permettant l'identification des marques m6A dans leurs séquences natives est réalisé à l'aide du nouvel algorithme récemment développé par Liu et al. (2019). L'algorithme repose sur la reconnaissance des perturbations caractéristiques du courant électrique par le m6A circulant à travers des nanopores protéiques spécifiques.

Séquençage de l'ADN - Afin d'identifier les événements d'édition de l'ARN A à I, un séquençage de nouvelle génération du génome entier est effectué pour tous les participants à l'étude afin de permettre une comparaison de bases ADN à ARN appariées (Park et al., 2012).

Bioinformatique - Afin d'interpréter les énormes ensembles de données issus du séquençage, des protocoles bioinformatiques sont développés en collaboration avec les équipes de bioinformatique de Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) et de l'Université technique du Moyen-Orient (professeur Nurcan Tuncbag). Les séquences sont évaluées par rapport à des bibliothèques de transcrits connues.

Méthodes cliniques - L'échocardiographie donne un aperçu de l'état fonctionnel du cœur et est réalisée avec des paramètres pré-spécifiés à la fois pendant l'hospitalisation initiale et 3 mois après l'ICP, le CABG ou l'AVR. Les rendez-vous de ces cardiologues comprennent l'évaluation de la gravité de l'angine de poitrine et de la dyspnée d'effort avec les classements CCS et NYHA, respectivement. De plus, l'auto-évaluation de la morbidité avec le questionnaire standardisé Short Form 36 Health Survey est incluse. De plus, une recherche dans le système de dossiers des patients comprenant les admissions à l'hôpital, les décès et les changements de médicaments associés à la santé cardiovasculaire est recueillie 6 mois avant et après l'opération.

Analyse de puissance - Les tailles de cohorte ont été déterminées avec l'outil Web RNAseqPS conçu pour évaluer la puissance statistique des expériences RNAseq (Guo et al., 2014). Les valeurs des paramètres utilisées (taux de fausses découvertes [FDR] < 0,05, nombre total de gènes à tester 20 000, gènes pronostiques prédits 1 500, seuil minimal de variation de 2 pour l'expression différentielle et nombre moyen de lectures de 10 pour les gènes pronostiques) ont été dérivées d'un rapport concernant l'épitranscriptomique au cours de l'IC (Berulava et al., 2020). Une valeur de dispersion génique pronostique de 0,215 a été appliquée sur la base de l'article consacré à la question par Yoon & Nam 2017, qui analysait les dispersions de dix ensembles de données RNA-seq accessibles au public, dont quatre reflétaient des répliques non apparentées applicables pour l'IHD-EPITRAN avec des dispersions allant entre 0,15 et 0,28.

Sur la base de l'analyse de puissance décrite ci-dessus, n=25 par cohorte fournit une puissance suffisante (P≥0,95). Pour aborder facilement les éventuelles erreurs préanalytiques, effectuer des analyses de validation et de suivi ultérieures, les cohortes ont été doublées.

Registres de patients

Les données d'identification des participants individuels collectées au cours de l'IHD-EPITRAN seront principalement stockées sous forme électronique sur les disques durs du réseau de HUS et de Tays qui sont protégés par des droits d'accès basés sur les rôles. Deux registres distincts sont créés pour l'IHD-EPITRAN : (1) Un registre clé, qui contient toutes les informations d'identification des participants et les liens entre les codes de pseudonymisation utilisés dans le (2) Registre de recherche (entièrement pseudonymisé) qui contient toutes les autres informations collectées sur l'étude de la part des participants. Antti Vento, le directeur de l'IHD-EPITRAN, a les droits d'accès au registre des clés. Les registres sont conservés pendant 10 ans pour permettre d'éventuels projets de suivi ultérieurs.

Des documents de description du traitement pour les deux registres, ainsi qu'un document d'auto-évaluation des risques de l'étude, ont été créés pour l'IHD-EPITRAN en finnois. Ces documents ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique du district hospitalier d'Helsinki et d'Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Groupe de recherche

Docent Antti Vento est le directeur du projet IHD-EPITRAN et du HUS Heart and Lung Center. L'équipe interdisciplinaire composée de cliniciens, de chercheurs fondamentaux et d'experts analytiques permet à l'IHD-EPITRAN d'effectuer en synergie le recrutement, la collecte et la préparation des échantillons suivis des analyses bioinformatiques du paysage épitranscriptomique des ARN circulants dans l'IHD. Les docteurs Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala et Satu Suihko, tous cardiologues de la station cardiaque HUS, effectueront le recrutement des patients CT, les analyses d'imagerie, le traitement des patients MI et, troisièmement, les rendez-vous de contrôle des patients MI, CABG et AVR . Le chirurgien cardiaque et vasculaire Kari Teittinen du HUS Heart and Lung Center, en collaboration avec le chirurgien cardiothoracique Jahangir Khan PhD et le professeur Jari Laurikka, tous deux du Tays Heart Hospital, effectuent le recrutement des patients CABG et AVR et leurs opérations. Les infirmières de recherche Kati Oksaharju et Kati Helleharju, du HUS Heart and Lung Center et du Tays Heart Hospital, coordonnent respectivement le recrutement des patients et, en étroite collaboration avec l'ouvrier Lahja Eurajoki, la collecte, le transport et le stockage rapide des échantillons après congélation. Le projet sera réalisé dans le laboratoire du professeur Esko Kankuri et du professeur Eero Mervaala (Université d'Helsinki, Groupe CardioReg, Département de pharmacologie). B. M. Vilbert Sikorski et MSc Daria Blokhina effectueront en collaboration l'isolement de l'ARN, le fractionnement, l'analyse UHPLC-LC-MS/MS et la formulation d'articles de protocole. De plus, Sikorski a planifié en collaboration un protocole d'étude avec les autres co-auteurs de l'IHD-EPITRAN, appliqué des autorisations d'étude et continue de coordonner l'échange d'informations entre les collaborateurs et effectue la rédaction d'articles sur les résultats avec les co-auteurs.

Éthique

Cette étude sera menée conformément au protocole approuvé par le comité d'éthique des HUS (Dnr. HUS/1211/2020). Les conseils régionaux et nationaux respectifs évalueront le protocole par la suite pour la collecte d'échantillons multicentriques. On veillera à ce que chaque participant à l'étude ait suffisamment de temps pour se familiariser avec le protocole de l'étude. Par la suite, une discussion sur le consentement éclairé aura lieu et un consentement éclairé écrit sera obtenu du participant.