Epitranskriptomiske blodbiomarkører for koronararteriesykdom - en prospektiv kohortstudie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Bakgrunn - Iskemisk hjertesykdom

Med en global prevalens på 126,5 millioner mennesker og en årlig dødelighet på 8,9 millioner, er iskemisk hjertesykdom (IHD) den ledende dødsårsaken (GBD Collaborators 2017). IHD utvikler seg som et resultat av en pågående aterogenese, en prosess med lipidoppbygging i veggene i koronararteriene. Til slutt danner akkumulering av kolesterol og kalsium avleiringer, dvs. plakk, som begrenser karets lumina. Ved begynnelsen av hjerteinfarkt (MI), brister en slik plakk, noe som fører til anoksisk død av myokardiet som er avhengig av blodtilførselen til fartøyet. På kort sikt reddes hjertets funksjon ved at det dannes et stivt arr. Over tid forverres pumpefunksjonen typisk med påfølgende hjertesvikt (HF).

Optimalt sett analyseres sykdomsbiomarkører fra blod og gir både innsikt i sykdomsprogresjon, alvorlighetsgrad og hjelper til med evaluering av terapieffektivitet. Dessverre er optimale biomarkører for IHD ikke identifisert til dags dato. Det store, men utallige antallet av de som lever med udiagnostisert IHD, som drar nytte av en tidlig diagnose, understreker behovet for en IHD-biomarkør.

Bakgrunn - Epitranskriptomikk

Epitranscriptomics, feltet for posttranskripsjonelle modifikasjoner av RNA, analogt med DNA-epigenetikk, har nylig fått mer vitenskapelig bemerkning (Saletore 2012). Dette ekspanderende feltet avdekker et nytt lag av biologisk regulering som kontrollerer prosesser som strekker seg fra cellespredning til død.

Selv om mer enn 170 RNA-modifikasjoner er identifisert i RNA-arter (Yang 2018), skiller adenosinmetylering seg ut i nitrogen-6-posisjonen (m6A) som en av de mest vanlige og mest studerte (Liu 2020). Etter de første funnene av m6A-metylerte mRNA-er på 1970-tallet (Desrosiers 1974), har epitranskriptomikk bare gjenoppstått i løpet av det siste tiåret med utviklingen av pålitelige in vivo-metoder for å vurdere m6A (Dominissini 2012). Disse tidlige immunutfellingsbaserte metodikkene (dvs. meRIP-seq) lettet oppdagelsene av de spesifikke m6A-tegnsettingsmønstrene og de spesifikt angitte forfatterne (metyltransferaser; METTL3/14/WTAP1-kompleks og METTL16), lesere (bindende proteiner; f.eks. YTH-proteinfamilie), og viskelær (demetylaser; ALKBH5; Zaccara 2019).

Flere lesere som formidler m6A-effektene fra YTH-domenefamilien er identifisert. YTHDF1-3 fremmer henholdsvis mRNA-translasjon, nedbrytning eller begge deler. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 og ribosomer gjenkjenner også m6A og fremmer translasjon og cytoplasmatisk kompartmentalisering (Zaccara 2019).

Endringer i m6A-nivåer har vært assosiert med en rekke patologier, inkludert kreft, kardiovaskulære og nevrologiske lidelser (Frye 2016). Studier som bruker både knockout og overuttrykk av m6A-skrivere og viskelær har avslørt deres rolle i å drive immunreaktivitet, celleproliferasjon, migrasjon og apoptose (Delaunay 2019).

Bakgrunn - Epitranskriptomikk & hjerte

Et nylig publisert sett med studier antyder en rolle for både m6A- og A-til-I-redigering (adenosin-til-inosin, en annen vanlig modifikasjon som diversifiserer transkriptomet ved å endre baseparing) under hypertensjon (Jain 2018), neovaskularisering (Kwast 2019) , myokardhypertrofi (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), iskemi (Mathiyalagan 2019) og HF (Berulava 2020). Mens en mengde bevis indikerer epitranskriptomikk som en bidragsyter til hjertehelse og sykdom, har alle de første studiene fokusert på myokard.

Begrunnelse, mål og betydning

Vi antar at patofysiologien til IHD gjenspeiles i epitranskriptomet til det sirkulerende RNA. For eksempel har ribosomalt RNA en lang halveringstid og dets modifikasjoner i koronarsirkulasjonen kan reagere på hjertets tilstand.

Målene for IHD-ERPITRAN-prosjektet er: (1) å etablere screeningprotokoller for epitranskriptomiske biomarkører, (2) gi epitranskriptomisk innsikt i IHD-patofysiologien, (3) identifisere et sett med IHD-biomarkørkandidater og (4) åpne veier for terapeutisk utvikling som tidligere ble sett bort fra på grunn av manglende forskning og metodiske begrensninger. For eksempel har forskningsgruppen vår rapportert en oppdagelse av småmolekylære ligander for RNA-metyltransferaser (Selberg 2019).

Siden epitranskriptomikk har blitt foreslått å spille en regulerende rolle i hjertet og IHD-EPITRAN er blant de første til å evaluere epitranskriptomiske blodbiomarkører i IHD, har prosjektet nøkkelen til et vitenskapelig gjennombrudd med forventede globale kliniske fordeler.

Metoder

Studiekohorter - 200 pasienter rekrutteres til fire kohorter, som teller 50 pasienter hver. Første kohort består av pasienter som presenterer til hjerteenheten med en akutt MI revaskularisert med perkutan koronar intervensjon (PCI), en kohort som gir verdifull innsikt i måten den akutte IHD-fenotypen speiles til blodepitranskriptomene. For det andre vil hovedstudiekohorten til prosjektet dannes fra pasienter med stabil IHD-fenotype behandlet med koronar bypass-grafting (CABG) og tilbyr kritisk informasjon med hensyn til kronisk iskemi og koronar aterogenese, begge pågående prosesser i det stille, dvs. udiagnostiserte, IHD. For det tredje gir pasienter som er bestemt for en aortaklafferstatningsbehandling (AVR) på grunn av stenose uten IHD den positive kontrollgruppen en annen hjertepatologi, og for det fjerde sammen med de friske ikke-IHD-pasientene verifisert med koronar computertomografi (CT). ), utgjør kontrollkohortene til prosjektet.

Studieprøver - IHD-EPITRAN avdekker blodcellulære og cellefrie RNA-epitranskriptomer fra de to ganger innsamlede TEMPUS(TM)- og EDTA-blodprøvene, henholdsvis. I tillegg, for MI- og CABG-kohorter, dechiffreres epitranskriptomene fra vevsprøver fra høyre atrial vedheng for et referansepunkt. Til slutt måles et sett med supplerende HF- og IHD-biomarkører: NT-proBNP, hsCRP, sST2 og TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 og Tibaut 2019).

RNA-metoder - RNA-isolering og fraksjonering med laboratorievaliderte metoder følges av kvantitativ analyse av syv basemodifikasjoner ved bruk av et UHPLC-trippel kvadrupol væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) system (Selberg 2019). Etter den kvantitative analysen utføres anti-m6A-antistoffbasert RNA-preseleksjon rik på m6A-merker i takt med sekvensering, dvs. meRIP-seq. Til syvende og sist, etter UHPLC-LC-MS/MS og meRIP-seq, utføres direkte nanopore langlest sekvensering som muliggjør identifisering av m6A-merkene i deres opprinnelige sekvenser ved å bruke den nye og nylig utviklede algoritmen av Liu et al. (2019). Algoritmen baserer seg på gjenkjennelsen av de karakteristiske forstyrrelsene av elektrisk strøm av m6A som strømmer gjennom spesifikke proteinnanoporer.

DNA-sekvensering - For å identifisere A-til-I RNA-redigeringshendelsene, utføres en neste generasjons sekvensering av hele genomet for alle studiedeltakerne for å muliggjøre en matchet DNA-til-RNA-base-sammenligning (Park et al., 2012).

Bioinformatikk - For å tolke de massive datasettene som er gitt fra sekvenseringen, utvikles bioinformatikkprotokoller i samarbeid med bioinformatikkteamene fra Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) og Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). Sekvensene blir evaluert mot kjente transkripsjonsbiblioteker.

Kliniske metoder - Ekkokardiografien gir innsikt i hjertets funksjonstilstand og utføres med forhåndsspesifiserte parametere både ved første sykehusinnleggelse og 3 måneder etter enten PCI, CABG eller AVR. Disse kardiologenes avtaler inkluderer alvorlighetsvurdering av angina pectoris og anstrengelsesdyspné med henholdsvis CCS- og NYHA-graderinger. I tillegg er sykelighetsegenvurdering med standardisert Short Form 36 Health Survey inkludert. I tillegg samles et pasientjournalsystem som inkluderer sykehusinnleggelser, dødsfall og medikamentendringer knyttet til kardiovaskulær helse 6 måneder før og etter operasjonen.

Kraftanalyse - Kohortstørrelsene ble bestemt med RNAseqPS-nettverktøy designet for å evaluere statistisk kraft for RNAseq-eksperimenter (Guo et al., 2014). Parameterverdier som ble brukt (falsk oppdagelsesrate [FDR] <0,05, totalt antall gener for testing 20 000, predikerte prognostiske gener 1500, minimum fold change-terskel 2 for differensialekspresjon og gjennomsnittlig avlesningstall på 10 for prognostiske gener) ble avledet fra en anvendelig rapport om epitranskriptomikk under HF (Berulava et al., 2020). Prognostisk genspredningsverdi på 0,215 ble brukt basert på artikkelen som fokuserte på problemet av Yoon & Nam 2017, som analyserte dispersjoner fra ti offentlig tilgjengelige RNA-seq-datasett, hvorav fire reflekterte ikke-relaterte replikater som var gjeldende for IHD-EPITRAN med dispersjonene som spenner mellom 0,15 og 0,28.

Basert på kraftanalysen beskrevet ovenfor, gir n=25 per kohort tilstrekkelig kraft (P≥0,95). For å flytende takle mulige preanalytiske feil, utføre påfølgende validering og oppfølgingsanalyser, ble kohortene doblet.

Pasientregistre

Individuell deltakeridentifikasjonsinformasjon som samles inn under IHD-EPITRAN vil hovedsakelig lagres i elektrisk form på HUS og Tays sine nettverksharddisker som er beskyttet av rollebaserte tilgangsrettigheter. To separate registre er opprettet for IHD-EPITRAN: (1) Et nøkkelregister, som inneholder all deltakeridentifikasjonsinformasjon og koblinger mellom pseudonymiseringskoder som brukes i (2) forskningsregisteret (helt pseudonymisert) som inneholder all annen innsamlet studieinformasjon fra deltakerne. Antti Vento, direktøren for IHD-EPITRAN, har tilgangsrettighetene til nøkkelregisteret. Registrene lagres i 10 år for å muliggjøre mulige senere oppfølgingsprosjekter.

Behandlingsbeskrivelsesdokumenter for begge registrene, sammen med selvvurderingsdokumenter for risikoene ved studien, er laget for IHD-EPITRAN på finsk. Disse dokumentene er gjennomgått og godkjent av Etikkrådet ved sykehusdistriktet i Helsingfors og Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Forskningsgruppe

Dosent Antti Vento er direktør for både IHD-EPITRAN-prosjektet og HUS hjerte- og lungesenter. Det tverrfaglige teamet sammensatt av klinikere, grunnleggende forskere og analytiske eksperter gjør det mulig for IHD-EPITRAN å synergistisk utføre rekruttering, prøveinnsamling og forberedelse etterfulgt av bioinformatiske analyser av det epitranskriptomiske landskapet til sirkulerende RNA i IHD. Dosentene Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala og Satu Suihko, alle kardiologer fra HUS hjertestasjon, skal gjennomføre CT-pasientenes rekruttering, bildediagnostiske analyser, behandling av MI-pasientene og for det tredje MI-, CABG- og AVR-pasienters kontrollavtaler . Hjerte- og karkirurg Kari Teittinen fra HUS hjerte- og lungesenter utfører sammen med hjerte- og thoraxkirurg Jahangir Khan PhD og professor Jari Laurikka, begge fra Tays Heart Hospital, rekrutteringen av CABG- og AVR-pasientene og deres operasjoner. Forskningssykepleierne Kati Oksaharju og Kati Helleharju, fra henholdsvis HUS hjerte- og lungesenter og Tays hjertesykehus, koordinerer pasientrekruttering og, i nært samarbeid med laborant Lahja Eurajoki, prøvetaking, transport og hurtiglagring etter frysing. Prosjektet vil bli utført i laboratoriet til dosent Esko Kankuri og professor Eero Mervaala (Universitetet i Helsingfors, CardioReg Group, Institutt for farmakologi). B.M. Vilbert Sikorski og MSc Daria Blokhina, vil i samarbeid utføre RNA-isolering, fraksjonering, UHPLC-LC-MS/MS-analyse og protokollartikkelformulering. I tillegg har Sikorski i samarbeid planlagt studieprotokoll med de andre IHD-EPITRAN-medforfatterne, søkt studietillatelser og fortsetter å koordinere informasjonsutveksling mellom samarbeidspartnere og utfører resultatartikkelskriving med medforfatterne.

Etikk

Denne studien vil bli utført i samsvar med protokollen godkjent av HUS Etikkråd (Dnr. HUS/1211/2020). Respektive regionale og nasjonale styrer vil evaluere protokollen i etterkant for multisenter prøvesamlingen. Det vil bli tatt hensyn til at hver studiedeltaker har nok tid til å gjøre seg kjent med studieprotokollen. Deretter vil det bli holdt en informert samtykkediskusjon og skriftlig informert samtykke innhentes fra deltakeren.