冠状动脉疾病的表观转录组血液生物标志物 - 一项前瞻性队列研究 (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

背景 - 缺血性心脏病

缺血性心脏病 (IHD) 的全球患病率为 1.265 亿，年死亡率为 890 万，是导致死亡的主要原因（GBD Collaborators 2017）。 IHD 的发展是持续的动脉粥样硬化形成的结果，动脉粥样硬化形成是脂质积聚到冠状动脉壁中的过程。 最终，胆固醇和钙的积累形成沉积物，即斑块，使血管腔变窄。 在心肌梗死（MI）发作时，这种斑块破裂，导致依赖血管供血的心肌缺氧死亡。 在短期内，心脏的功能会因僵硬疤痕的形成而得以恢复。 随着时间的推移，泵送功能通常会随着随后发生的心力衰竭 (HF) 而恶化。

最理想的是，疾病生物标志物是从血液中分析出来的，可以提供对疾病进展、严重程度的洞察力，并有助于评估治疗效果。 不幸的是，迄今为止尚未确定 IHD 的最佳生物标志物。 大量但无法统计的未确诊 IHD 患者受益于早期诊断，这凸显了对 IHD 生物标志物的需求。

背景——表观转录组学

表观转录组学是 RNA 转录后修饰的领域，类似于 DNA 表观遗传学，最近获得了更多的科学评价（Saletore 2012）。 这个不断扩大的领域揭示了一个新的生物调控层，它控制着从细胞增殖到死亡的过程。

尽管已在 RNA 物种中鉴定出超过 170 种 RNA 修饰 (Yang 2018)，但氮 6 位 (m6A) 的腺苷甲基化是最常见且研究最深入的修饰之一 (Liu 2020)。 继 1970 年代 m6A 甲基化 mRNA 的初步发现 (Desrosiers 1974) 之后，表观转录组学在过去十年中随着可靠的体内方法的发展而重新点燃，以评估 m6A (Dominissini 2012)。 这些早期基于免疫沉淀的方法（即 meRIP-seq）有助于发现特定的 m6A 标点符号模式和特别表示的写入器（甲基转移酶；METTL3/14/WTAP1 复合物和 METTL16）、读取器（结合蛋白；例如 YTH-蛋白家族）和橡皮擦（去甲基化酶；ALKBH5；Zaccara 2019）。

已经确定了调节来自 YTH 域家族的 m6A 效应的多个阅读器。 YTHDF1-3 分别促进 mRNA 翻译、降解或两者。 YTHDC1-2、eIF2、METTL3 和核糖体也能识别 m6A 并促进翻译和细胞质区室化 (Zaccara 2019)。

m6A 水平的变化与许多病理学有关，包括癌症、心血管和神经系统疾病（Frye 2016）。 使用 m6A 写入器和擦除器的敲除和过表达的研究揭示了它们在驱动免疫反应、细胞增殖、迁移和凋亡方面的作用 (Delaunay 2019)。

背景 - 表观转录组学和心脏

最近发表的一组研究表明，m6A 和 A-to-I 编辑（腺苷到肌苷，另一种通过改变碱基配对使转录组多样化的常见修饰）在高血压（Jain 2018）、新血管形成（Kwast 2019）期间发挥作用、心肌肥大 (Dorn 2019、Kmietczyk 2019)、缺血 (Mathiyalagan 2019) 和 HF (Berulava 2020)。 虽然大量证据表明表观转录组学对心脏健康和疾病有影响，但所有最初的研究都集中在心肌上。

理由、目标和意义

我们假设 IHD 的病理生理学反映在循环 RNA 的表观转录组中。 例如，核糖体 RNA 具有较长的半衰期，其在冠状循环中的修饰可以对心脏状态作出反应。

IHD-ERPITRAN 项目的目标是：(1) 建立表观转录组生物标志物的筛选方案，(2) 提供对 IHD 病理生理学的表观转录组学洞察，(3) 确定一组 IHD 生物标志物候选物，以及 (4) 开辟治疗途径以前由于缺乏研究和方法上的限制而被忽视的发展。 例如，我们的研究小组报告发现了 RNA 甲基转移酶的小分子配体 (Selberg 2019)。

由于表观转录组学被认为在心脏中发挥调节作用，并且 IHD-EPITRAN 是首批评估 IHD 表观转录组血液生物标志物的项目之一，因此该项目是科学突破的关键，具有可预期的全球临床效益。

方法

研究队列——200 名患者被招募到四个队列中，每组 50 名患者。 第一个队列由通过经皮冠状动脉介入治疗 (PCI) 进行血运重建的急性 MI 就诊至 Heart Unit 的患者组成，该队列对急性 IHD 表型反映到血液表观转录组的方式提供了宝贵的见解。 其次，该项目的主要研究队列将由接受冠状动脉旁路移植术 (CABG) 治疗的具有稳定 IHD 表型的患者组成，并提供有关慢性缺血和冠状动脉粥样硬化形成的关键信息，这两个过程都在悄无声息中进行，即未确诊，高清。 第三，由于狭窄而注定要接受主动脉瓣置换术 (AVR) 治疗但没有 IHD 的患者为阳性对照组提供了不同的心脏病理，第四，与经冠状动脉计算机断层扫描 (CT) 验证的健康非 IHD 患者一起), 形成项目的控制队列。

研究样本——IHD-EPITRAN 分别从两次收集的 TEMPUS(TM) 和 EDTA 血液样本中揭示血细胞和无细胞 RNA 表观转录组。 此外，对于 MI 和 CABG 队列，来自右心耳组织样本的表观转录组被破译为参考点。 最后，测量了一组补充性 HF 和 IHD 生物标志物：NT-proBNP、hsCRP、sST2 和 TMAO（Aimo 2019、Ahmadmehrabi 2017 和 Tibaut 2019）。

RNA 方法——使用经过实验室验证的方法进行 RNA 分离和分离后，使用 UHPLC-三重四极杆液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 系统对七种碱基修饰进行定量分析（Selberg 2019）。 在定量分析之后，进行了基于抗 m6A 抗体的富含 m6A 标记的 RNA 预选与测序，即 meRIP-seq。 最终，在 UHPLC-LC-MS/MS 和 meRIP-seq 之后，使用 Liu 等人最近开发的新算法进行直接纳米孔长读长测序，能够识别其天然序列中的 m6A 标记。 （2019）。 该算法基于对流过特定蛋白质纳米孔的 m6A 电流的特征中断的识别。

DNA 测序——为了识别 A-to-I RNA 编辑事件，对所有研究参与者进行全基因组下一代测序，以实现匹配的 DNA-to-RNA 碱基比较（Park 等人，2012 年）。

生物信息学——为了解释测序产生的大量数据集，生物信息学协议是与 Folkhälsan（Karolinska Institutet，Shintaro Katayma 博士）和中东技术大学（Nurcan Tuncbag 教授）的生物信息学团队合作开发的。 这些序列是根据已知的转录文库进行评估的。

临床方法 - 超声心动图可以深入了解心脏的功能状态，并在初次住院期间和 PCI、CABG 或 AVR 后 3 个月内使用预先指定的参数进行检查。 这些心脏病专家的任命包括分别使用 CCS 和 NYHA 分级评估心绞痛和劳力性呼吸困难的严重程度。 此外，还包括使用标准化简式 36 健康调查进行的发病率自我评估。 此外，在手术前后 6 个月收集患者记录系统搜索，包括入院、死亡和与心血管健康相关的药物变化。

功效分析——队列大小是用 RNAseqPS 网络工具确定的，该工具专为评估 RNAseq 实验的统计功效而设计（Guo 等人，2014 年）。 使用的参数值（错误发现率 [FDR] <0.05，用于测试的基因总数 20 000，预测的预后基因 1500，差异表达的最小倍数变化阈值 2 和预后基因的平均读取计数 10）来自适用的有关 HF 期间表观转录组学的报告（Berulava 等人，2020 年）。 基于 Yoon & Nam 2017 年关注该问题的文章应用了 0,215 的预后基因分散值，该文章分析了十个公开可用的 RNA-seq 数据集的分散，其中四个反映了适用于 IHD-EPITRAN 的不相关重复，分散范围在 0.15 和 0.28 之间。

基于上述功效分析，每组 n=25 提供了足够的功效 (P≥0,95)。 为了流畅地解决可能的分析前错误，执行后续验证和后续分析，队列增加了一倍。

病人登记处

IHD-EPITRAN期间收集的个人参与者身份信息数据将主要以电子形式存储在HUS和Tays的网络硬盘上，并受基于角色的访问权限保护。 为 IHD-EPITRAN 创建了两个单独的注册表：(1) 一个密钥注册表，其中包含所有参与者身份信息和假名代码之间的链接，这些代码在 (2) 研究注册表（完全假名）中使用，其中包含所有其他收集的研究信息来自参与者。 IHD-EPITRAN 的负责人 Antti Vento 拥有 Key Registry 的加入权。 注册表会保存 10 年，以支持以后可能的后续项目。

已为芬兰语的 IHD-EPITRAN 创建了两个注册处的处理描述文件，以及研究风险的自我评估文件。 这些文件已经过赫尔辛基和乌西马区医院伦理委员会的审查和批准（Dnr. HUS/1211/2020）。

课题组

Docent Antti Vento 是 IHD-EPITRAN 项目和 HUS 心肺中心的主任。 由临床医生、基础研究人员和分析专家组成的跨学科团队使 IHD-EPITRAN 能够协同执行招募、样本收集和制备，然后对 IHD 中循环 RNA 的表观转录组景观进行生物信息学分析。 Docents Mika Laine、Pasi Karjalainen、Helena Rajala 和 Satu Suihko 都是 HUS 心脏站的心脏病专家，他们将负责 CT 患者的招募、影像分析、MI 患者的治疗，以及 MI、CABG 和 AVR 患者的对照预约. 来自HUS心肺中心的心脏和血管外科医生Kari Teittinen与来自Tays心脏医院的心胸外科医生Jahangir Khan博士和Jari Laurikka教授一起进行CABG和AVR患者的招募和手术。 分别来自 HUS 心肺中心和 Tays 心脏医院的研究护士 Kati Oksaharju 和 Kati Helleharju 协调患者招募，并与实验室的 Lahja Eurajoki 密切合作，进行样本采集、运输和冷冻后的及时储存。 该项目将在讲解员 Esko Kankuri 和 Eero Mervaala 教授（赫尔辛基大学 CardioReg Group 药理学系）的实验室进行。 B.M. Vilbert Sikorski 和理学硕士 Daria Blokhina 将合作执行 RNA 分离、分馏、UHPLC-LC-MS/MS 分析和方案文章制定。 此外，Sikorski 还与其他 IHD-EPITRAN 合著者合作规划了研究方案，申请了研究许可并继续协调合作者之间的信息交流，并与合著者一起撰写结果文章。

伦理

本研究将按照 HUS 伦理委员会 (Dnr. HUS/1211/2020）。 各自的区域和国家委员会随后将评估多中心样本收集的协议。 将小心谨慎，以便每个研究参与者都有足够的时间来熟悉研究方案。 此后，将举行知情同意讨论并获得参与者的书面知情同意。