Epitranskriptomiske blodbiomarkører for koronararteriesygdom - et prospektivt kohortestudie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Baggrund - Iskæmisk hjertesygdom

Med en global prævalens på 126,5 millioner mennesker og en årlig dødelighed på 8,9 millioner er iskæmisk hjertesygdom (IHD) den førende dødsårsag (GBD Collaborators 2017). IHD udvikler sig som et resultat af en igangværende atherogenese, en proces med lipidopbygning i kranspulsårernes vægge. Til sidst danner ophobningen af ​​kolesterol og calcium aflejringer, det vil sige plaques, der indsnævrer karets lumina. Ved begyndelsen af ​​myokardieinfarkt (MI), brister en sådan plak, hvilket fører til anoksisk død af myokardiet, der er afhængig af blodforsyningen af ​​karret. På kort sigt reddes hjertets funktion ved dannelsen af ​​et stift ar. Med tiden forringes pumpefunktionen typisk med efterfølgende hjertesvigt (HF).

Optimalt analyseres sygdomsbiomarkører fra blod og giver både indsigt i sygdomsprogression, sværhedsgrad og hjælper med at evaluere terapiens effektivitet. Desværre er optimale biomarkører for IHD ikke blevet identificeret til dato. Det store, men utallige antal af dem, der lever med udiagnosticeret IHD, og ​​som nyder godt af en tidlig diagnose, understreger behovet for en IHD-biomarkør.

Baggrund - Epitranscriptomics

Epitranscriptomics, feltet for posttranskriptionelle modifikationer af RNA, analogt med DNA-epigenetik, har for nylig fået mere videnskabelig bemærkning (Saletore 2012). Dette ekspanderende felt afdækker et nyt lag af biologisk regulering, der styrer processer lige fra celleproliferation til død.

Selvom mere end 170 RNA-modifikationer er blevet identificeret i RNA-arter (Yang 2018), skiller adenosin-methylering sig ud i nitrogen-6-positionen (m6A) som en af ​​de mest almindelige og mest undersøgte (Liu 2020). Efter de første fund af m6A-methylerede mRNA'er i 1970'erne (Desrosiers 1974), er epitranskriptomik kun genopstået i løbet af det sidste årti med udviklingen af ​​pålidelige in vivo-metoder til at vurdere m6A (Dominissini 2012). Disse tidlige immunpræcipitationsbaserede metoder (dvs. meRIP-seq) lettede opdagelserne af de specifikke m6A-tegnsætningsmønstre og de specifikt betegnede forfattere (methyltransferaser; METTL3/14/WTAP1-kompleks og METTL16), læsere (bindingsproteiner; f.eks. YTH-proteinfamilie) og viskelædere (demethylaser; ALKBH5; Zaccara 2019).

Flere læsere, der medierer m6A-effekterne fra YTH-domænefamilien, er blevet identificeret. YTHDF1-3 fremmer henholdsvis mRNA-translation, nedbrydning eller begge dele. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 og ribosomer genkender også m6A og fremmer translation og cytoplasmatisk kompartmentalisering (Zaccara 2019).

Ændringer i m6A-niveauer er blevet forbundet med adskillige patologier, herunder cancer, kardiovaskulære og neurologiske lidelser (Frye 2016). Undersøgelser, der bruger både knockout og overekspression af m6A-skrivere og viskelædere har afsløret deres rolle i at drive immunreaktivitet, celleproliferation, migration og apoptose (Delaunay 2019).

Baggrund - Epitranscriptomics & heart

Et nyligt offentliggjort sæt undersøgelser tyder på en rolle for både m6A- og A-til-I-redigering (adenosin-til-inosin, en anden almindelig modifikation, der diversificerer transkriptomet ved at ændre baseparringen) under hypertension (Jain 2018), neovaskularisering (Kwast 2019) , myokardiehypertrofi (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), iskæmi (Mathiyalagan 2019) og HF (Berulava 2020). Mens en mængde beviser indikerer epitranskriptomik som en bidragyder til hjertesundhed og sygdom, har alle de indledende undersøgelser fokuseret på myokardiet.

Begrundelse, mål og betydning

Vi antager, at patofysiologien af ​​IHD afspejles i epitranskriptomet af det cirkulerende RNA. For eksempel har ribosomalt RNA en lang halveringstid, og dets modifikationer i koronarkredsløbet kan reagere på hjertets tilstand.

Målene for IHD-ERPITRAN-projektet er: (1) at etablere screeningsprotokoller for epitranskriptomiske biomarkører, (2) give epitranskriptomisk indsigt i IHD-patofysiologien, (3) identificere et sæt IHD-biomarkørkandidater og (4) åbne muligheder for terapeutisk udvikling, der tidligere blev tilsidesat på grund af manglende forskning og metodiske begrænsninger. For eksempel har vores forskningsgruppe rapporteret en opdagelse af små molekyle ligander for RNA methyltransferaser (Selberg 2019).

Da epitranskriptomik er blevet foreslået at spille en regulerende rolle i hjertet, og IHD-EPITRAN er blandt de første til at evaluere epitranskriptomiske blodbiomarkører i IHD, har projektet nøglerne til et videnskabeligt gennembrud med forventelige globale kliniske fordele.

Metoder

Studiekohorter - 200 patienter rekrutteres til fire kohorter, der hver tæller 50 patienter. Første kohorte består af patienter, der præsenterer sig for hjerteafdelingen med en akut MI revaskulariseret med perkutan koronar intervention (PCI), en kohorte, der giver værdifuld indsigt i, hvordan den akutte IHD-fænotype spejles i blodets epitranskriptomer. For det andet vil hovedstudiekohorten af ​​projektet blive dannet af patienter med stabil IHD-fænotype behandlet med koronararterie-bypass-grafting (CABG) og tilbyder kritisk information med hensyn til kronisk iskæmi og koronar atherogenese, begge igangværende processer i det stille, dvs. udiagnosticeret, IHD. For det tredje giver patienter, der er bestemt til en aortaklaperstatningsbehandling (AVR) på grund af stenose uden IHD, den positive kontrolgruppe en forskellig hjertepatologi, og for det fjerde sammen med de raske ikke-IHD-patienter verificeret med koronar computertomografi (CT). ), udgør projektets kontrolkohorter.

Undersøgelsesprøver - IHD-EPITRAN afslører blodcelle- og cellefri RNA-epitranskriptomer fra henholdsvis de to gange indsamlede TEMPUS(TM)- og EDTA-blodprøver. For MI- og CABG-kohorter dechifreres epitranskriptomerne fra vævsprøver fra højre atrielle vedhæng til et referencepunkt. Til sidst måles et sæt supplerende HF- og IHD-biomarkører: NT-proBNP, hsCRP, sST2 og TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 og Tibaut 2019).

RNA-metoder - RNA-isoleringen og fraktioneringen med laboratorievaliderede metoder efterfølges af den kvantitative analyse af syv basemodifikationer ved hjælp af et UHPLC-triple quadrupole væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) system (Selberg 2019). Efter den kvantitative analyse udføres anti-m6A-antistof-baseret RNA-forudvælgelse rig på m6A-mærker i tandem med sekventering, dvs. meRIP-seq. I sidste ende, efter UHPLC-LC-MS/MS og meRIP-seq, udføres direkte nanopore langlæst sekvensering, der muliggør identifikation af m6A-mærkerne i deres native sekvenser, ved hjælp af den nye og nyligt udviklede algoritme af Liu et al. (2019). Algoritmen er baseret på genkendelsen af ​​de karakteristiske forstyrrelser af elektrisk strøm af m6A, der strømmer gennem specifikke protein-nanoporer.

DNA-sekventering - For at identificere A-til-I RNA-redigeringshændelser udføres en næste generations sekvensering af hele genomet for alle undersøgelsesdeltagere for at muliggøre en matchet DNA-til-RNA-base-sammenligning (Park et al., 2012).

Bioinformatik - For at fortolke de massive datasæt, der opnås fra sekventeringen, udvikles bioinformatikprotokoller i samarbejde med bioinformatikholdene fra Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) og Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). Sekvenserne evalueres mod kendte transkriptbiblioteker.

Kliniske metoder - Ekkokardiografien giver indsigt i hjertets funktionstilstand og udføres med foruddefinerede parametre både under den indledende indlæggelse og 3 måneder efter enten PCI, CABG eller AVR. Disse kardiologers aftaler omfatter sværhedsgradsvurderingen af ​​angina pectoris og anstrengelsesdyspnø med henholdsvis CCS- og NYHA-graderinger. Derudover indgår sygeligheds-selvvurdering med den standardiserede Short Form 36 Health Survey. Desuden indsamles en patientjournalsystemsøgning, herunder hospitalsindlæggelser, dødsfald og medicinændringer i forbindelse med kardiovaskulær sundhed 6 måneder før og efter operationen.

Effektanalyse - Kohortestørrelserne blev bestemt med RNAseqPS-webværktøj designet til at evaluere statistisk styrke for RNAseq-eksperimenter (Guo et al., 2014). De anvendte parameterværdier (falsk opdagelsesrate [FDR] <0,05, samlet antal gener til testning af 20.000, forudsagte prognostiske gener 1500, minimumsfoldændringstærskel 2 for differentiel ekspression og gennemsnitlige læsetal på 10 for prognostiske gener) blev afledt fra en anvendelig rapport vedrørende epitranskriptomik under HF (Berulava et al., 2020). Prognostisk genspredningsværdi på 0.215 blev anvendt baseret på artiklen, der fokuserede på problemet af Yoon & Nam 2017, som analyserede spredninger fra ti offentligt tilgængelige RNA-seq-datasæt, hvoraf fire afspejlede ikke-relaterede replikater, der var gældende for IHD-EPITRAN med spredningerne i spændvidde mellem 0,15 og 0,28.

Baseret på effektanalysen beskrevet ovenfor giver n=25 pr. kohorte tilstrækkelig kraft (P≥0,95). For flydende at tackle mulige præanalytiske fejl, udføre efterfølgende validering og opfølgende analyser, blev kohorterne fordoblet.

Patientregistre

Individuelle deltageridentifikationsoplysninger indsamlet under IHD-EPITRAN vil hovedsageligt blive lagret i elektrisk form på HUS's og Tays' netværksharddiske, der er beskyttet af rollebaserede adgangsrettigheder. To separate registre oprettes for IHD-EPITRAN: (1) Et nøgleregister, som indeholder alle deltageridentifikationsoplysninger og links mellem pseudonymiseringskoder, der bruges i (2) forskningsregisteret (fuldt pseudonymiseret), der indeholder alle andre indsamlede undersøgelsesoplysninger fra deltagerne. Antti Vento, direktøren for IHD-EPITRAN, har adgangsrettighederne til nøgleregistret. Registrene opbevares i 10 år for at muliggøre senere opfølgningsprojekter.

Behandlingsbeskrivelsesdokumenter for begge registre, sammen med selvvurderingsdokumenter for risici ved undersøgelsen, er blevet oprettet til IHD-EPITRAN på finsk. Disse dokumenter er blevet gennemgået og godkendt af det etiske råd for hospitalsdistriktet i Helsinki og Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Forskningsgruppe

Docent Antti Vento er direktør for både IHD-EPITRAN-projektet og HUS hjerte- og lungecenter. Det tværfaglige team bestående af klinikere, grundforskere og analytiske eksperter gør IHD-EPITRAN i stand til synergistisk at udføre rekruttering, prøveindsamling og forberedelse efterfulgt af de bioinformatiske analyser af det epitranskriptomiske landskab af cirkulerende RNA i IHD. Docenterne Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala og Satu Suihko, alle kardiologer fra HUS hjertestation, skal udføre CT-patienternes rekruttering, billeddiagnostiske analyser, behandling af MI-patienterne og for det tredje MI-, CABG- og AVR-patienters kontrolaftaler . Hjerte- og karkirurg Kari Teittinen fra HUS Hjerte- og Lungecenter varetager sammen med hjertekirurgen Jahangir Khan PhD og professor Jari Laurikka, begge fra Tays Heart Hospital, rekrutteringen af ​​CABG- og AVR-patienterne og deres operationer. Forskningssygeplejerskerne Kati Oksaharju og Kati Helleharju fra henholdsvis HUS Hjerte- og Lungecenter og Tays Hjertehospital koordinerer patientrekruttering og i tæt samarbejde med laborant Lahja Eurajoki prøveudtagning, transport og hurtig opbevaring efter frysning. Projektet vil blive udført i laboratoriet af docent Esko Kankuri og professor Eero Mervaala (Universitetet i Helsinki, CardioReg Group, Institut for Farmakologi). B.M. Vilbert Sikorski og MSc Daria Blokhina, vil i samarbejde udføre RNA-isolering, fraktionering, UHPLC-LC-MS/MS-analyse og protokolartikelformulering. Derudover har Sikorski i samarbejde planlagt undersøgelsesprotokol med de andre IHD-EPITRAN-medforfattere, anvendt undersøgelsestilladelser og fortsætter med at koordinere informationsudveksling mellem samarbejdspartnere og udfører resultatartikelskrivning med medforfatterne.

Etik

Denne undersøgelse vil blive udført i overensstemmelse med protokollen godkendt af HUS Etikråd (Dnr. HUS/1211/2020). Respektive regionale og nationale bestyrelser vil efterfølgende evaluere protokollen for multicenterprøveindsamlingen. Der vil blive sørget for, at hver forsøgsdeltager har tid nok til at sætte sig ind i undersøgelsesprotokollen. Herefter vil der blive afholdt en informeret samtykkediskussion og skriftligt informeret samtykke indhentet fra deltageren.