Эпитранскриптомные биомаркеры крови для ишемической болезни сердца - проспективное когортное исследование (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Предыстория - ишемическая болезнь сердца

При глобальной распространенности 126,5 млн человек и ежегодной смертности 8,9 млн ишемическая болезнь сердца (ИБС) является ведущей причиной смерти (GBD Collaborators 2017). ИБС развивается в результате продолжающегося атерогенеза, процесса накопления липидов в стенках коронарных артерий. В конечном итоге накопление холестерина и кальция приводит к образованию отложений, то есть бляшек, которые сужают просвет сосуда. В начале инфаркта миокарда (ИМ) такая бляшка разрывается, что приводит к аноксической гибели миокарда, зависящего от кровоснабжения сосуда. В краткосрочной перспективе функция сердца восстанавливается за счет образования жесткого рубца. Со временем насосная функция обычно ухудшается с последующей сердечной недостаточностью (СН).

В оптимальном случае биомаркеры заболевания анализируются из крови и дают представление о прогрессировании и тяжести заболевания, а также помогают оценить эффективность терапии. К сожалению, оптимальные биомаркеры ИБС до настоящего времени не определены. Огромное, но неучтенное число людей с невыявленной ИБС, которым помогает ранняя диагностика, подчеркивает необходимость биомаркера ИБС.

Предыстория - Эпитранскриптомика

Эпитранскриптомика, область посттранскрипционных модификаций РНК, аналогичная эпигенетике ДНК, в последнее время получила большее научное признание (Saletore 2012). Эта расширяющаяся область открывает новый уровень биологической регуляции, которая контролирует процессы, начиная от пролиферации клеток и заканчивая их гибелью.

Хотя у видов РНК было идентифицировано более 170 модификаций РНК (Yang 2018), метилирование аденозина в положении азота-6 (m6A) выделяется как одно из наиболее распространенных и интенсивно изучаемых (Liu 2020). После первых открытий метилированных мРНК m6A в 1970-х (Desrosiers 1974) эпитранскриптомика вновь активизировалась в течение последнего десятилетия с разработкой надежных методов in vivo для оценки m6A (Dominissini 2012). Эти ранние методологии, основанные на иммунопреципитации (т. meRIP-seq) способствовала открытию специфических паттернов пунктуации m6A и специально обозначенных авторов (метилтрансферазы; комплекс METTL3/14/WTAP1 и METTL16), считывателей (связывающие белки; например, семейство белков YTH) и ластики (деметилазы; ALKBH5; Zaccara 2019).

Было идентифицировано множество ридеров, опосредующих эффекты m6A из семейства доменов YTH. YTHDF1-3 способствует трансляции, деградации мРНК или тому и другому соответственно. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 и рибосомы также распознают m6A и способствуют трансляции и цитоплазматической компартментализации (Zaccara 2019).

Изменения уровней m6A связаны с многочисленными патологиями, включая рак, сердечно-сосудистые и неврологические расстройства (Frye 2016). Исследования с использованием как нокаута, так и сверхэкспрессии писателей и ластиков m6A выявили их роль в управлении иммунной реактивностью, пролиферацией клеток, миграцией и апоптозом (Delaunay 2019).

Предыстория - эпитранскриптомика и сердце

Недавно опубликованный набор исследований предполагает роль редактирования как m6A, так и A-to-I (аденозин-в-инозин, еще одна распространенная модификация, диверсифицирующая транскриптом путем изменения спаривания оснований) при гипертонии (Jain 2018), неоваскуляризации (Kwast 2019) , гипертрофия миокарда (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ишемия (Mathiyalagan 2019) и СН (Berulava 2020). В то время как совокупность данных указывает на то, что эпитранскриптомика способствует здоровью и заболеваниям сердца, все первоначальные исследования были сосредоточены на миокарде.

Обоснование, цели и значение

Мы предполагаем, что патофизиология ИБС отражается в эпитранскриптоме циркулирующей РНК. Например, рибосомная РНК имеет длительный период полураспада, и ее модификации в коронарном кровотоке могут реагировать на состояние сердца.

Целями проекта IHD-ERPITRAN являются: (1) разработка протоколов скрининга эпитранскриптомных биомаркеров, (2) обеспечение эпитранскриптомного понимания патофизиологии ИБС, (3) идентификация набора биомаркеров-кандидатов ИБС и (4) открытие возможностей для терапевтических разработки, которые ранее игнорировались из-за отсутствия исследований и методологических ограничений. Например, наша исследовательская группа сообщила об открытии низкомолекулярных лигандов для РНК-метилтрансфераз (Selberg 2019).

Поскольку предполагается, что эпитранскриптомика играет регулирующую роль в сердце, а IHD-EPITRAN является одним из первых, кто оценивает эпитранскриптомные биомаркеры крови при ИБС, проект является ключом к научному прорыву с ожидаемыми глобальными клиническими преимуществами.

Методы

Когорты исследования - 200 пациентов набираются в четыре когорты по 50 пациентов в каждой. Первая группа состоит из пациентов, поступающих в кардиологическое отделение с острым ИМ, реваскуляризированным с помощью чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ), когорта, которая дает ценную информацию о том, как острый фенотип ИБС отражается в эпитранскриптомах крови. Во-вторых, основная исследовательская группа проекта будет сформирована из пациентов со стабильным фенотипом ИБС, пролеченных с помощью аортокоронарного шунтирования (АКШ), и предоставит важную информацию в отношении хронической ишемии и коронарного атерогенеза, как текущих процессов в скрытом, т.е. ИБС. В-третьих, пациенты, которым назначено протезирование аортального клапана (ЗАК) по поводу стеноза без ИБС, составляют группу положительного контроля с различной кардиальной патологией и, в-четвертых, вместе со здоровыми пациентами без ИБС, верифицированными с помощью коронарной компьютерной томографии (КТ). ), формируют контрольные когорты проекта.

Образцы для исследования - IHD-EPITRAN обнаруживает эпитранскриптомы клеточной и внеклеточной РНК крови из дважды отобранных образцов крови TEMPUS™ и EDTA, соответственно. Кроме того, для когорт ИМ и АКШ эпитранскриптомы из образцов ткани ушка правого предсердия расшифровываются для ориентира. Наконец, измеряется набор дополнительных биомаркеров СН и ИБС: NT-proBNP, hsCRP, sST2 и TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 и Tibaut 2019).

Методы РНК. За выделением и фракционированием РНК с помощью проверенных в лаборатории методов следует количественный анализ семи основных модификаций с использованием системы УВЭЖХ-тройной квадрупольной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) (Selberg 2019). После количественного анализа проводится предварительная селекция РНК на основе антител против m6A, богатая метками m6A, в тандеме с секвенированием, то есть meRIP-seq. В конечном счете, после УВЭЖХ-ЖХ-МС/МС и meRIP-seq проводится прямое секвенирование с длительным считыванием нанопор, позволяющее идентифицировать метки m6A в их нативных последовательностях, с использованием нового и недавно разработанного алгоритма Liu et al. (2019). Алгоритм основан на распознавании характерных нарушений электрического тока m6A, протекающего через определенные белковые нанопоры.

Секвенирование ДНК. Чтобы идентифицировать события редактирования РНК A-to-I, для всех участников исследования выполняется секвенирование всего генома следующего поколения, чтобы обеспечить сравнение согласованных оснований ДНК и РНК (Park et al., 2012).

Биоинформатика. Для интерпретации массивных наборов данных, полученных в результате секвенирования, протоколы биоинформатики разрабатываются в сотрудничестве с группами биоинформатики из Фолкхэлсана (Каролинский институт, доктор Шинтаро Катайма) и Ближневосточного технического университета (профессор Нуркан Тунчбаг). Последовательности оценивают по сравнению с известными библиотеками транскриптов.

Клинические методы. Эхокардиография дает представление о функциональном состоянии сердца и выполняется с заранее заданными параметрами как во время первичной госпитализации, так и через 3 месяца после ЧКВ, АКШ или ПАК. Назначения этих кардиологов включают оценку тяжести стенокардии и одышки при физической нагрузке по шкале CCS и NYHA соответственно. Кроме того, включена самооценка заболеваемости с помощью стандартизированной краткой формы 36 обследования состояния здоровья. Кроме того, за 6 месяцев до и после операции собирается система поиска пациентов, включая госпитализации, смерти и изменения лекарств, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Анализ мощности. Размеры когорт определялись с помощью веб-инструмента RNAseqPS, предназначенного для оценки статистической мощности экспериментов с RNAseq (Guo et al., 2014). Используемые значения параметров (частота ложных открытий [FDR] <0,05, общее количество генов для тестирования 20 000, предсказанные прогностические гены 1500, порог минимального кратного изменения 2 для дифференциальной экспрессии и среднее количество прочтений 10 для прогностических генов) были получены из применимого отчет об эпитранскриптомике во время HF (Berulava et al., 2020). Прогностическое значение дисперсии генов, равное 0,215, было применено на основании статьи Yoon & Nam 2017, посвященной этому вопросу, в которой анализировались дисперсии из десяти общедоступных наборов данных RNA-seq, четыре из которых отражали неродственные повторы, применимые для IHD-EPITRAN, с дисперсиями в диапазоне от 0,15 до 0,28.

На основании анализа мощности, описанного выше, n=25 на когорту обеспечивает достаточную мощность (P≥0,95). Чтобы быстро устранить возможные преаналитические ошибки, выполнить последующую проверку и последующий анализ, когорты были удвоены.

Регистры пациентов

Данные об идентификации отдельных участников, собранные во время IHD-EPITRAN, будут в основном храниться в электрической форме на сетевых жестких дисках HUS и Tays, которые защищены правами доступа на основе ролей. Для IHD-EPITRAN создаются два отдельных реестра: (1) Реестр ключей, который содержит всю идентификационную информацию об участниках и ссылки между кодами псевдонимизации, которые используются в (2) Реестре исследований (полностью псевдонимизированном), который содержит всю другую собранную информацию об исследовании. от участников. Антти Венто, директор IHD-EPITRAN, имеет права доступа к Реестру ключей. Реестры хранятся в течение 10 лет, чтобы обеспечить возможность последующих проектов.

Документы описания обработки для обоих реестров, наряду с документом самооценки рисков исследования, были созданы для IHD-EPITRAN на финском языке. Эти документы были рассмотрены и одобрены Советом по этике Больничного округа Хельсинки и Уусимаа (Dnr. HUS/1211/2020).

Исследовательская группа

Доцент Антти Венто является директором проекта IHD-EPITRAN и Центра сердца и легких HUS. Междисциплинарная команда, состоящая из клиницистов, основных исследователей и экспертов-аналитиков, позволяет IHD-EPITRAN синергетически выполнять набор, сбор и подготовку образцов с последующим биоинформационным анализом эпитранскриптомного ландшафта циркулирующей РНК при ИБС. Доценты Мика Лайне, Паси Карьялайнен, Хелена Раджала и Сату Суихко, все кардиологи из кардиологической станции HUS, будут проводить набор пациентов для КТ, анализ изображений, лечение пациентов с ИМ и, в-третьих, контрольные приемы пациентов с ИМ, АКШ и ЗАК. . Сердечный и сосудистый хирург Кари Тейттинен из Центра сердца и легких HUS вместе с кардиоторакальным хирургом Джахангиром Ханом, доктором медицинских наук, и профессором Яри Лаурикка, оба из кардиологической больницы Тайс, проводят набор пациентов с АКШ и ЗАК и их операции. Медсестры-исследователи Кати Оксахарью и Кати Хеллехарью из Центра сердца и легких HUS и Кардиологического госпиталя Тайс, соответственно, координируют набор пациентов и, в тесном сотрудничестве с лаборанткой Лахья Эурайоки, сбор образцов, их транспортировку и быстрое хранение после замораживания. Проект будет осуществляться в лаборатории доцента Эско Канкури и профессора Ээро Мерваала (Университет Хельсинки, CardioReg Group, кафедра фармакологии). Б.М. Вильберт Сикорский и магистр наук Дарья Блохина будут совместно проводить выделение РНК, фракционирование, анализ УВЭЖХ-ЖХ-МС/МС и составление протокола статьи. Кроме того, Sikorski совместно с другими соавторами IHD-EPITRAN спланировал протокол исследования, применил разрешения на исследование и продолжает координировать обмен информацией между соавторами и осуществляет написание статей о результатах с соавторами.

Этика

Это исследование будет проводиться в соответствии с протоколом, одобренным Советом по этике HUS (Dnr. HUS/1211/2020). Соответствующие региональные и национальные советы впоследствии оценят протокол многоцентрового сбора образцов. Будут приняты меры, чтобы у каждого участника исследования было достаточно времени для ознакомления с протоколом исследования. После этого будет проведено обсуждение информированного согласия, и от участника будет получено письменное информированное согласие.