Epitranscriptomische bloedbiomarkers voor coronaire hartziekte - een prospectieve cohortstudie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Achtergrond - Ischemische hartziekte

Met een wereldwijde prevalentie van 126,5 miljoen mensen en een jaarlijkse sterfte van 8,9 miljoen is ischemische hartziekte (IHD) de belangrijkste doodsoorzaak (GBD Collaborators 2017). IHD ontwikkelt zich als gevolg van een voortdurende atherogenese, een proces van opbouw van lipiden in de wanden van de kransslagaders. Uiteindelijk vormt de opeenhoping van cholesterol en calcium afzettingen, d.w.z. plaques, die de lumina van het bloedvat vernauwen. Bij het begin van een myocardinfarct (MI) scheurt zo'n plaque, wat leidt tot anoxische dood van het myocardium, afhankelijk van de bloedtoevoer van het vat. Op korte termijn wordt de hartfunctie gered door de vorming van een stijf litteken. Na verloop van tijd verslechtert de pompfunctie typisch met als gevolg hartfalen (HF).

Optimaal worden ziektebiomarkers geanalyseerd uit bloed en geven zowel inzicht in ziekteprogressie als ernst en helpen bij de evaluatie van de werkzaamheid van de therapie. Helaas zijn tot op heden geen optimale biomarkers voor IHD geïdentificeerd. Het enorme maar ontelbare aantal mensen met niet-gediagnosticeerde IHD, die baat hebben bij een vroege diagnose, onderstrepen de noodzaak van een IHD-biomarker.

Achtergrond - Epitranscriptomica

Epitranscriptomics, het gebied van de posttranscriptionele modificaties van RNA, analoog aan DNA-epigenetica, heeft recent meer wetenschappelijke aandacht gekregen (Saletore 2012). Dit groeiende veld onthult een nieuwe laag van biologische regulatie die processen regelt die variëren van celproliferatie tot dood.

Hoewel er meer dan 170 RNA-modificaties zijn geïdentificeerd in RNA-soorten (Yang 2018), valt adenosinemethylering op de stikstof-6-positie (m6A) op als een van de meest voorkomende en intensief bestudeerde (Liu 2020). Na de eerste bevindingen van m6A-gemethyleerde mRNA's in de jaren 1970 (Desrosiers 1974), is epitranscriptomics pas in het laatste decennium weer opgelaaid met de ontwikkeling van betrouwbare in vivo methoden om m6A te beoordelen (Dominissini 2012). Deze vroege op immunoprecipitatie gebaseerde methodologieën (d.w.z. meRIP-seq) vergemakkelijkte de ontdekking van de specifieke m6A-interpunctiepatronen en de specifiek aangeduide schrijvers (methyltransferasen; METTL3/14/WTAP1-complex en METTL16), lezers (bindende eiwitten; b.v. YTH-eiwitfamilie) en gummen (demethylasen; ALKBH5; Zaccara 2019).

Er zijn meerdere lezers geïdentificeerd die de m6A-effecten van de YTH-domeinfamilie bemiddelen. YTHDF1-3 bevordert respectievelijk mRNA-translatie, afbraak of beide. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 en ribosomen herkennen ook m6A en bevorderen translatie en cytoplasmatische compartimentering (Zaccara 2019).

Veranderingen in m6A-niveaus zijn in verband gebracht met tal van pathologieën, waaronder kanker, cardiovasculaire en neurologische aandoeningen (Frye 2016). Studies die zowel knock-out als overexpressie van de m6A-schrijvers en gummen gebruiken, hebben hun rol onthuld bij het stimuleren van immuunreactiviteit, celproliferatie, migratie en apoptose (Delaunay 2019).

Achtergrond - Epitranscriptomics & hart

Een recent gepubliceerde reeks onderzoeken suggereert een rol voor zowel de m6A- als de A-naar-I-bewerking (adenosine-naar-inosine, een andere veel voorkomende modificatie die het transcriptoom diversifieert door de basenparing te veranderen) tijdens hypertensie (Jain 2018), neovascularisatie (Kwast 2019) , myocardiale hypertrofie (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ischemie (Mathiyalagan 2019) en HF (Berulava 2020). Hoewel er veel bewijs is dat epitranscriptomica een bijdrage levert aan de gezondheid en ziekte van het hart, waren alle eerste onderzoeken gericht op het myocardium.

Grondgedachte, doelstellingen en betekenis

Onze hypothese is dat de pathofysiologie van IHD wordt weerspiegeld in het epitranscriptoom van het circulerende RNA. Ribosomaal RNA heeft bijvoorbeeld een lange halfwaardetijd en de modificaties ervan in de coronaire circulatie kunnen reageren op de toestand van het hart.

De doelstellingen van het IHD-ERPITRAN-project zijn: (1) screeningprotocollen opstellen voor epitranscriptomische biomarkers, (2) epitranscriptomisch inzicht verschaffen in de IHD-pathofysiologie, (3) een reeks IHD-biomarkerkandidaten identificeren en (4) wegen openen voor therapeutische ontwikkeling die voorheen buiten beschouwing werd gelaten wegens gebrek aan onderzoek en methodologische beperkingen. Onze onderzoeksgroep heeft bijvoorbeeld melding gemaakt van een ontdekking van liganden met kleine moleculen voor RNA-methyltransferasen (Selberg 2019).

Aangezien is gesuggereerd dat epitranscriptomics een regulerende rol spelen in het hart en de IHD-EPITRAN een van de eersten is die epitranscriptomische bloedbiomarkers in IHD evalueert, bevat het project de sleutels voor een wetenschappelijke doorbraak met verwachte wereldwijde klinische voordelen.

methoden

Studiecohorten - 200 patiënten worden gerekruteerd in vier cohorten, elk met 50 patiënten. Het eerste cohort bestaat uit patiënten die zich bij de harteenheid melden met een acuut MI dat is gerevasculariseerd met percutane coronaire interventie (PCI), een cohort dat waardevol inzicht geeft in de manier waarop het acute IHD-fenotype wordt weerspiegeld in de epitranscriptomen van het bloed. Ten tweede zal het hoofdonderzoekscohort van het project worden gevormd uit patiënten met een stabiel IHD-fenotype die worden behandeld met coronaire bypass-transplantatie (CABG) en kritische informatie biedt met betrekking tot chronische ischemie en coronaire atherogenese, beide lopende processen in de stille, d.w.z. niet-gediagnosticeerde, IHD. Ten derde geven patiënten die bestemd zijn voor een aortaklepvervangingstherapie (AVR) vanwege stenose zonder IHD de positieve controlegroep een andere cardiale pathologie, en ten vierde, samen met de gezonde niet-IHD-patiënten geverifieerd met de coronaire computertomografie (CT). ), vormen de controlecohorten van het project.

Studiemonsters - De IHD-EPITRAN onthult bloedcellulaire en celvrije RNA-epitranscriptomen van respectievelijk de tweemaal verzamelde TEMPUS(TM)- en EDTA-bloedmonsters. Bovendien worden voor MI- en CABG-cohorten de epitranscriptomen van de weefselmonsters van het rechter atriumaanhangsel ontcijferd voor een referentiepunt. Tot slot wordt een set aanvullende HF- en IHD-biomarkers: NT-proBNP, hsCRP, sST2 en TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 en Tibaut 2019) gemeten.

RNA-methoden - De RNA-isolatie en -fractionering met in het laboratorium gevalideerde methoden wordt gevolgd door de kwantitatieve analyse van zeven basenmodificaties met behulp van een UHPLC-triple quadrupool vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-systeem (Selberg 2019). Na de kwantitatieve analyse wordt op anti-m6A antilichaam gebaseerde RNA-preselectie uitgevoerd die rijk is aan m6A-markeringen in combinatie met sequencing, d.w.z. meRIP-seq. Uiteindelijk, na de UHPLC-LC-MS/MS en meRIP-seq, wordt directe nanopore long-read sequencing die identificatie van de m6A-markeringen in hun oorspronkelijke sequenties mogelijk maakt, uitgevoerd met behulp van het nieuwe en recent ontwikkelde algoritme door Liu et al. (2019). Het algoritme is gebaseerd op de herkenning van de karakteristieke verstoringen van elektrische stroom door de m6A die door specifieke eiwitnanoporiën stroomt.

DNA-sequencing - Om de A-naar-I RNA-bewerkingsgebeurtenissen te identificeren, wordt een next-generation sequencing van het hele genoom uitgevoerd voor alle deelnemers aan de studie om een ​​matchende DNA-naar-RNA-basevergelijking mogelijk te maken (Park et al., 2012).

Bio-informatica - Om de enorme datasets die uit de sequencing zijn voortgekomen te interpreteren, worden bio-informatica-protocollen ontwikkeld in samenwerking met de bio-informatica-teams van Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) en Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). De sequenties worden geëvalueerd tegen bekende transcriptbibliotheken.

Klinische methoden - De echocardiografie geeft inzicht in de functionele toestand van het hart en wordt uitgevoerd met vooraf gespecificeerde parameters, zowel tijdens de eerste ziekenhuisopname als 3 maanden na PCI, CABG of AVR. De afspraken van deze cardiologen omvatten de beoordeling van de ernst van angina pectoris en inspanningsdyspnoe met respectievelijk CCS- en NYHA-classificaties. Daarnaast is een zelfbeoordeling van de morbiditeit met de gestandaardiseerde Short Form 36 Health Survey inbegrepen. Bovendien wordt 6 maanden voor en na de operatie een patiëntendossiersysteem doorzocht, inclusief ziekenhuisopnames, sterfgevallen en medicatieveranderingen die verband houden met cardiovasculaire gezondheid.

Vermogensanalyse - De cohortgroottes werden bepaald met de RNAseqPS-webtool die is ontworpen voor het evalueren van statistisch vermogen voor RNAseq-experimenten (Guo et al., 2014). Gebruikte parameterwaarden (valse ontdekkingssnelheid [FDR] <0,05, totaal aantal genen voor testen 20.000, voorspelde prognostische genen 1500, minimale vouwveranderingsdrempel 2 voor differentiële expressie en gemiddelde leestellingen van 10 voor prognostische genen) werden afgeleid van een toepasselijke rapport over epitranscriptomics tijdens HF (Berulava et al., 2020). Prognostische gendispersiewaarde van 0,215 werd toegepast op basis van het artikel over de kwestie door Yoon & Nam 2017, waarin dispersies van tien openbaar beschikbare RNA-seq-datasets werden geanalyseerd, waarvan er vier niet-gerelateerde replica's weerspiegelden die van toepassing zijn op de IHD-EPITRAN met de dispersies variërend van tussen 0,15 en 0,28.

Op basis van de hierboven beschreven poweranalyse geeft n=25 per cohort voldoende power (P≥0,95). Om mogelijke preanalytische fouten vlot aan te pakken, validatie- en vervolganalyses uit te voeren, werden de cohorten verdubbeld.

Patiëntenregistraties

Identificatiegegevens van individuele deelnemers die tijdens de IHD-EPITRAN worden verzameld, zullen voornamelijk in elektrische vorm worden opgeslagen op de harde schijven van het netwerk van HUS en Tays, die worden beschermd door op rollen gebaseerde toegangsrechten. Er worden twee afzonderlijke registers aangemaakt voor de IHD-EPITRAN: (1) een basisregistratie, die alle deelnemersidentificatie-informatie bevat en koppelingen tussen pseudonimiseringscodes die worden gebruikt in de (2) Onderzoeksregistratie (volledig gepseudonimiseerd) die alle andere verzamelde onderzoeksinformatie bevat van de deelnemers. Antti Vento, de directeur van de IHD-EPITRAN, heeft de toetredingsrechten tot de Basisregistratie. De registers worden 10 jaar bewaard om eventuele latere vervolgprojecten mogelijk te maken.

Verwerkingsbeschrijvingsdocumenten voor beide registers, naast een zelfbeoordelingsdocument voor de risico's van het onderzoek, zijn gemaakt voor de IHD-EPITRAN in het Fins. Deze documenten zijn beoordeeld en goedgekeurd door de ethische raad van het ziekenhuisdistrict van Helsinki en Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Onderzoeksgroep

Docent Antti Vento is de directeur van zowel het IHD-EPITRAN-project als het HUS Hart- en Longcentrum. Het interdisciplinaire team bestaande uit clinici, basisonderzoekers en analytische experts stelt de IHD-EPITRAN in staat om op synergetische wijze werving, monsterverzameling en voorbereiding uit te voeren, gevolgd door de bioinformatische analyses van het epitranscriptomische landschap van circulerend RNA in IHD. Docenten Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala en Satu Suihko, alle cardiologen van het HUS-hartstation, zullen de CT-patiëntenrekrutering, beeldvormingsanalyses, behandeling van de MI-patiënten en, ten derde, MI-, CABG- en AVR-patiëntencontroleafspraken uitvoeren . Hart- en vaatchirurg Kari Teittinen van het HUS Hart- en longcentrum, samen met de cardiothoracale chirurg Jahangir Khan PhD en professor Jari Laurikka, beiden van het Tays Heart Hospital, voeren de werving uit van de CABG- en AVR-patiënten en hun operaties. Onderzoeksverpleegkundigen Kati Oksaharju en Kati Helleharju, respectievelijk van HUS Heart and Lung Center en Tays Heart Hospital, coördineren de rekrutering van patiënten en, in nauwe samenwerking met laborant Lahja Eurajoki, de monsterverzameling, het transport en de snelle opslag na het invriezen. Het project wordt uitgevoerd in het laboratorium van docent Esko Kankuri en professor Eero Mervaala (Universiteit van Helsinki, CardioReg Group, Afdeling Farmacologie). BM Vilbert Sikorski en MSc Daria Blokhina zullen gezamenlijk RNA-isolatie, fractionering, UHPLC-LC-MS/MS-analyse en protocolartikelformulering uitvoeren. Bovendien heeft Sikorski samen met de andere IHD-EPITRAN co-auteurs een studieprotocol opgesteld, studietoestemmingen toegepast en blijft hij de informatie-uitwisseling tussen medewerkers coördineren en schrijft hij samen met de co-auteurs resultatenartikelen.

Ethiek

Deze studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de HUS Ethics Board (Dnr. HUS/1211/2020). Respectievelijke regionale en nationale besturen zullen het protocol vervolgens evalueren voor de monsterafname in meerdere centra. Er zal voor worden gezorgd dat elke deelnemer aan het onderzoek voldoende tijd heeft om vertrouwd te raken met het onderzoeksprotocol. Daarna zal een geïnformeerd toestemmingsgesprek worden gehouden en zal schriftelijke geïnformeerde toestemming van de deelnemer worden verkregen.