Biomarcadores sanguíneos epitranscriptómicos para la enfermedad de las arterias coronarias: un estudio de cohorte prospectivo (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Antecedentes - Cardiopatía isquémica

Con una prevalencia mundial de 126,5 millones de personas y una mortalidad anual de 8,9 millones, la cardiopatía isquémica (CI) es la principal causa de muerte (GBD Collaborators 2017). La CI se desarrolla como resultado de una aterogénesis en curso, un proceso de acumulación de lípidos en las paredes de las arterias coronarias. Finalmente, la acumulación de colesterol y calcio forma depósitos, es decir, placas, que estrechan la luz de los vasos. Al comienzo del infarto de miocardio (IM), dicha placa se rompe, lo que conduce a la muerte anóxica del miocardio que depende del suministro de sangre del vaso. A corto plazo, la función del corazón se recupera mediante la formación de una cicatriz rígida. Con el tiempo, la función de bombeo generalmente se deteriora con la consiguiente insuficiencia cardíaca (IC).

De manera óptima, los biomarcadores de la enfermedad se analizan a partir de la sangre y brindan información sobre la progresión y la gravedad de la enfermedad y ayudan a evaluar la eficacia de la terapia. Desafortunadamente, hasta la fecha no se han identificado biomarcadores óptimos para la cardiopatía isquémica. El gran número, aunque incontable, de personas que viven con cardiopatía isquémica no diagnosticada y que se benefician de un diagnóstico temprano, subraya la necesidad de un biomarcador de cardiopatía isquémica.

Antecedentes - Epitranscriptómica

La epitranscriptómica, el campo de las modificaciones postranscripcionales del ARN, análoga a la epigenética del ADN, ha ganado recientemente más atención científica (Saletore 2012). Este campo en expansión está descubriendo una nueva capa de regulación biológica que controla procesos que van desde la proliferación celular hasta la muerte.

Aunque se han identificado más de 170 modificaciones de ARN en especies de ARN (Yang 2018), la metilación de adenosina en la posición de nitrógeno-6 (m6A) se destaca como una de las más comunes y estudiadas intensamente (Liu 2020). Tras los hallazgos iniciales de mRNA metilados de m6A en la década de 1970 (Desrosiers 1974), la epitranscriptómica solo se ha reactivado durante la última década con el desarrollo de métodos in vivo confiables para evaluar m6A (Dominissini 2012). Estas primeras metodologías basadas en la inmunoprecipitación (es decir, meRIP-seq) facilitó los descubrimientos de los patrones de puntuación específicos de m6A y los escritores específicamente indicados (metiltransferasas; complejo METTL3/14/WTAP1 y METTL16), lectores (proteínas de unión; p. familia de proteínas YTH) y borradores (desmetilasas; ALKBH5; Zaccara 2019).

Se han identificado múltiples lectores que median los efectos m6A de la familia de dominios YTH. YTHDF1-3 promueve la traducción, la degradación o ambas, respectivamente, del ARNm. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 y los ribosomas también reconocen m6A y promueven la traducción y la compartimentación citoplasmática (Zaccara 2019).

Los cambios en los niveles de m6A se han asociado con numerosas patologías, incluidos cánceres, trastornos cardiovasculares y neurológicos (Frye 2016). Los estudios que utilizan tanto la desactivación como la sobreexpresión de los escritores y borradores de m6A han revelado su papel en el impulso de la reactividad inmunitaria, la proliferación celular, la migración y la apoptosis (Delaunay 2019).

Antecedentes - Epitranscriptómica y corazón

Un conjunto de estudios publicado recientemente sugiere un papel tanto para la edición de m6A como de A a I (adenosina a inosina, otra modificación común que diversifica el transcriptoma al alterar el emparejamiento de bases) durante la hipertensión (Jain 2018), la neovascularización (Kwast 2019) , hipertrofia miocárdica (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), isquemia (Mathiyalagan 2019) e IC (Berulava 2020). Si bien un cuerpo de evidencia indica que la epitranscriptómica contribuye a la salud y la enfermedad cardíacas, todos los estudios iniciales se han centrado en el miocardio.

Justificación, objetivos y significado

Nuestra hipótesis es que la fisiopatología de la cardiopatía isquémica se refleja en el epitranscriptoma del ARN circulante. Por ejemplo, el ARN ribosomal tiene una vida media larga y sus modificaciones en la circulación coronaria pueden responder al estado del corazón.

Los objetivos del proyecto IHD-ERPITRAN son: (1) establecer protocolos de detección para biomarcadores epitranscriptómicos, (2) proporcionar información epitranscriptómica sobre la fisiopatología de la IHD, (3) identificar un conjunto de candidatos a biomarcadores de la IHD y (4) abrir vías para el tratamiento terapéutico. desarrollo que antes se desestimaban por falta de investigación y limitaciones metodológicas. Por ejemplo, nuestro grupo de investigación ha informado sobre el descubrimiento de ligandos de moléculas pequeñas para metiltransferasas de ARN (Selberg 2019).

Dado que se ha sugerido que la epitranscriptómica desempeña un papel regulador en el corazón y que IHD-EPITRAN se encuentra entre los primeros en evaluar biomarcadores sanguíneos epitranscriptómicos en la cardiopatía isquémica, el proyecto tiene las claves para un avance científico con beneficios clínicos globales esperados.

Métodos

Cohortes de estudio: se reclutan 200 pacientes en cuatro cohortes, con 50 pacientes cada una. La primera cohorte consta de pacientes que se presentan en la Unidad del Corazón con un IM agudo revascularizado con intervención coronaria percutánea (PCI), una cohorte que brinda información valiosa sobre la forma en que el fenotipo de la cardiopatía isquémica aguda se refleja en los epitranscriptomas sanguíneos. En segundo lugar, la principal cohorte de estudio del proyecto se formará a partir de pacientes con fenotipo de CI estable tratados con injerto de derivación de arteria coronaria (CABG) y ofrece información crítica con respecto a la isquemia crónica y la aterogénesis coronaria, ambos procesos en curso en el silencioso, es decir, no diagnosticado, IHD. En tercer lugar, los pacientes destinados a una terapia de reemplazo de válvula aórtica (RVA) por estenosis sin CI proporcionan el grupo de control positivo con una patología cardíaca diferente y, en cuarto lugar, junto con los pacientes sanos sin CI verificados con la tomografía computarizada coronaria (TC ), forman las cohortes de control del proyecto.

Muestras de estudio: el IHD-EPITRAN descubre epitranscriptomas de ARN celular y libre de células sanguíneas de las muestras de sangre TEMPUS(TM) y EDTA recolectadas dos veces, respectivamente. Además, para las cohortes MI y CABG, los epitranscriptomas de las muestras de tejido del apéndice auricular derecho se descifran como punto de referencia. Finalmente, se miden un conjunto de biomarcadores complementarios de IC y CI: NT-proBNP, hsCRP, sST2 y TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 y Tibaut 2019).

Métodos de ARN: el aislamiento y el fraccionamiento del ARN con métodos validados en el laboratorio son seguidos por el análisis cuantitativo de siete modificaciones de base utilizando un sistema UHPLC de cromatografía líquida de triple cuadrupolo y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Después del análisis cuantitativo, se realiza una preselección de ARN basada en anticuerpos anti-m6A rica en marcas m6A junto con la secuenciación, es decir, meRIP-seq. En última instancia, después de UHPLC-LC-MS/MS y meRIP-seq, se lleva a cabo la secuenciación directa de lectura larga de nanoporos que permite la identificación de las marcas m6A en sus secuencias nativas utilizando el algoritmo novedoso y recientemente desarrollado por Liu et al. (2019). El algoritmo se basa en el reconocimiento de las interrupciones características de la corriente eléctrica por parte del m6A que fluye a través de nanoporos de proteínas específicas.

Secuenciación de ADN: para identificar los eventos de edición de ARN A a I, se realiza una secuenciación de próxima generación del genoma completo para todos los participantes del estudio para permitir una comparación de bases de ADN a ARN coincidentes (Park et al., 2012).

Bioinformática: para interpretar los conjuntos de datos masivos generados por la secuenciación, se desarrollan protocolos de bioinformática en colaboración con los equipos de bioinformática de Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) y la Universidad Técnica de Oriente Medio (profesor Nurcan Tuncbag). Las secuencias se evalúan frente a bibliotecas de transcritos conocidas.

Métodos clínicos: la ecocardiografía brinda información sobre el estado funcional del corazón y se realiza con parámetros preespecificados tanto durante la hospitalización inicial como 3 meses después de PCI, CABG o AVR. Las citas de estos cardiólogos incluyen la evaluación de la gravedad de la angina de pecho y la disnea de esfuerzo con grados CCS y NYHA, respectivamente. Además, se incluye la autoevaluación de morbilidad con la Encuesta de Salud Short Form 36 estandarizada. Además, una búsqueda en el sistema de registro de pacientes que incluye ingresos hospitalarios, muertes y cambios de medicación asociados a la salud cardiovascular se recopilan 6 meses antes y después de la operación.

Análisis de potencia: los tamaños de las cohortes se determinaron con la herramienta web RNAseqPS diseñada para evaluar la potencia estadística de los experimentos RNAseq (Guo et al., 2014). Los valores de los parámetros utilizados (tasa de descubrimiento falso [FDR] <0,05, número total de genes para la prueba 20 000, genes pronósticos predichos 1500, umbral de cambio mínimo 2 para expresión diferencial y recuentos de lectura promedio de 10 para genes pronósticos) se derivaron de un informe sobre la epitranscriptómica durante la IC (Berulava et al., 2020). Se aplicó un valor pronóstico de dispersión de genes de 0,215 en base al artículo centrado en el tema de Yoon & Nam 2017, que analizó las dispersiones de diez conjuntos de datos de RNA-seq disponibles públicamente, cuatro de los cuales reflejaron réplicas no relacionadas aplicables para IHD-EPITRAN con las dispersiones que van entre 0,15 y 0,28.

Según el análisis de potencia descrito anteriormente, n=25 por cohorte proporciona potencia suficiente (P≥0,95). Para abordar con fluidez posibles errores preanalíticos, realizar posteriores análisis de validación y seguimiento, se duplicaron las cohortes.

Registros de pacientes

Los datos de información de identificación de participantes individuales recopilados durante el IHD-EPITRAN se almacenarán principalmente en forma eléctrica en los discos duros de la red de HUS y Tays que están protegidos por derechos de acceso basados ​​en funciones. Se crean dos registros separados para el IHD-EPITRAN: (1) Un Registro clave, que contiene toda la información de identificación de los participantes y enlaces entre los códigos de seudonimización que se utilizan en el (2) Registro de investigación (completamente seudonimizado) que contiene toda la demás información recopilada del estudio de los participantes. Antti Vento, director del IHD-EPITRAN, tiene los derechos de acceso al Registro de Claves. Los registros se almacenan durante 10 años para permitir posibles proyectos de seguimiento posteriores.

Se han creado documentos de descripción de procesamiento para ambos registros, junto con un documento de autoevaluación de los riesgos del estudio, para el IHD-EPITRAN en finés. Estos documentos han sido revisados ​​y aprobados por la Junta de Ética del Distrito Hospitalario de Helsinki y Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Grupo de investigacion

Docent Antti Vento es el director tanto del proyecto IHD-EPITRAN como del HUS Heart and Lung Center. El equipo interdisciplinario compuesto por médicos, investigadores básicos y expertos analíticos permite que IHD-EPITRAN realice de forma sinérgica el reclutamiento, la recolección y preparación de muestras seguido de los análisis bioinformáticos del panorama epitranscriptómico del ARN circulante en IHD. Los docentes Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala y Satu Suihko, todos cardiólogos de la estación cardíaca HUS, llevarán a cabo el reclutamiento de pacientes con TC, análisis de imágenes, tratamiento de pacientes con IM y, en tercer lugar, citas de control de pacientes con IM, CABG y AVR. . El cirujano cardíaco y vascular Kari Teittinen del HUS Heart and Lung Center, junto con el cirujano cardiotorácico Jahangir Khan PhD y el profesor Jari Laurikka, ambos del Tays Heart Hospital, llevan a cabo el reclutamiento de pacientes CABG y AVR y sus operaciones. Las enfermeras de investigación Kati Oksaharju y Kati Helleharju, del HUS Heart and Lung Center y Tays Heart Hospital, respectivamente, coordinan el reclutamiento de pacientes y, en estrecha colaboración con la laboratorista Lahja Eurajoki, la recolección, el transporte y el almacenamiento rápido de muestras después de la congelación. El proyecto se llevará a cabo en el laboratorio del docente Esko Kankuri y el profesor Eero Mervaala (Universidad de Helsinki, Grupo CardioReg, Departamento de Farmacología). B. M. Vilbert Sikorski y MSc Daria Blokhina, realizarán en colaboración aislamiento de ARN, fraccionamiento, análisis UHPLC-LC-MS/MS y formulación de artículos de protocolo. Además, Sikorski ha planificado en colaboración el protocolo del estudio con los otros coautores de IHD-EPITRAN, ha solicitado los permisos del estudio y continúa coordinando el intercambio de información entre los colaboradores y lleva a cabo la redacción de artículos de resultados con los coautores.

Ética

Este estudio se llevará a cabo de conformidad con el protocolo aprobado por la Junta de Ética de HUS (Dnr. HUS/1211/2020). Las juntas regionales y nacionales respectivas evaluarán el protocolo posteriormente para la recolección de muestras multicéntrica. Se tendrá cuidado de que cada participante del estudio tenga suficiente tiempo para familiarizarse con el protocolo del estudio. A partir de entonces, se llevará a cabo una discusión sobre el consentimiento informado y se obtendrá el consentimiento informado por escrito del participante.