Biomarcadores sanguíneos epitranscriptômicos para doença arterial coronariana - um estudo de coorte prospectivo (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Antecedentes - Doença Cardíaca Isquêmica

Com uma prevalência global de 126,5 milhões de pessoas e uma mortalidade anual de 8,9 milhões, a doença cardíaca isquêmica (DIC) é a principal causa de morte (GBD Collaborators 2017). A DIC se desenvolve como resultado de uma aterogênese contínua, um processo de acúmulo de lipídios nas paredes das artérias coronárias. Eventualmente, o acúmulo de colesterol e cálcio forma depósitos, ou seja, placas, que estreitam o lúmen do vaso. No início do infarto do miocárdio (IM), essa placa se rompe, o que leva à morte anóxica do miocárdio, dependendo do suprimento sanguíneo do vaso. A curto prazo, a função do coração é resgatada pela formação de uma cicatriz rígida. Com o tempo, a função de bombeamento geralmente se deteriora com a consequente insuficiência cardíaca (IC).

Idealmente, os biomarcadores da doença são analisados ​​a partir do sangue e fornecem informações sobre a progressão e a gravidade da doença e ajudam na avaliação da eficácia da terapia. Infelizmente, biomarcadores ideais para IHD não foram identificados até o momento. O vasto mas incontável número de pessoas que vivem com DIC não diagnosticada, beneficiando-se de um diagnóstico precoce, ressalta a necessidade de um biomarcador de DIC.

Contexto - Epitranscriptômica

A epitranscriptômica, o campo das modificações pós-transcricionais do RNA, análoga à epigenética do DNA, ganhou recentemente mais destaque científico (Saletore 2012). Este campo em expansão está revelando uma nova camada de regulação biológica que controla processos que vão desde a proliferação celular até a morte.

Embora mais de 170 modificações de RNA tenham sido identificadas em espécies de RNA (Yang 2018), a metilação da adenosina na posição do nitrogênio-6 (m6A) se destaca como uma das mais comuns e intensamente estudadas (Liu 2020). Após as descobertas iniciais de mRNAs metilados de m6A na década de 1970 (Desrosiers 1974), a epitranscriptômica só reacendeu durante a última década com o desenvolvimento de métodos in vivo confiáveis ​​para avaliar m6A (Dominissini 2012). Essas metodologias iniciais baseadas em imunoprecipitação (i.e. meRIP-seq) facilitou as descobertas dos padrões de pontuação m6A específicos e os escritores especificamente denotados (metiltransferases; complexo METTL3/14/WTAP1 e METTL16), leitores (proteínas de ligação; por exemplo família de proteínas YTH) e apagadores (desmetilases; ALKBH5; Zaccara 2019).

Múltiplos leitores mediando os efeitos m6A da família de domínio YTH foram identificados. YTHDF1-3 promove a tradução do mRNA, degradação ou ambos, respectivamente. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 e ribossomos também reconhecem m6A e promovem tradução e compartimentalização citoplasmática (Zaccara 2019).

Alterações nos níveis de m6A foram associadas a inúmeras patologias, incluindo cânceres, distúrbios cardiovasculares e neurológicos (Frye 2016). Estudos usando nocaute e superexpressão dos escritores e apagadores m6A revelaram seu papel na condução da reatividade imunológica, proliferação celular, migração e apoptose (Delaunay 2019).

Contexto - Epitranscriptômica e coração

Um conjunto de estudos recentemente publicado sugere um papel para a edição de m6A e A-para-I (adenosina-para-inosina, outra modificação comum que diversifica o transcriptoma alterando o pareamento de bases) durante hipertensão (Jain 2018), neovascularização (Kwast 2019) , hipertrofia miocárdica (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), isquemia (Mathiyalagan 2019) e IC (Berulava 2020). Embora um corpo de evidências indique a epitranscriptômica como um contribuinte na saúde e na doença cardíaca, todos os estudos iniciais se concentraram no miocárdio.

Justificativa, objetivos e significado

Nossa hipótese é que a fisiopatologia da DIC se reflete no epitranscriptoma do RNA circulante. Por exemplo, o RNA ribossômico tem meia-vida longa e suas modificações na circulação coronária podem responder ao estado do coração.

Os objetivos do projeto IHD-ERPITRAN são: (1) estabelecer protocolos de triagem para biomarcadores epitranscriptômicos, (2) fornecer informações epitranscriptômicas sobre a fisiopatologia da DIC, (3) identificar um conjunto de candidatos a biomarcadores de DIC e (4) abrir caminhos para terapias desenvolvimento que antes eram desconsiderados por falta de pesquisa e limitações metodológicas. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa relatou a descoberta de ligantes de moléculas pequenas para metiltransferases de RNA (Selberg 2019).

Uma vez que foi sugerido que a epitranscriptômica desempenha um papel regulador no coração e o IHD-EPITRAN está entre os primeiros a avaliar os biomarcadores sanguíneos epitranscriptômicos na DIC, o projeto contém as chaves para um avanço científico com benefícios clínicos globais esperados.

Métodos

Coortes de estudo - 200 pacientes são recrutados em quatro coortes, contando com 50 pacientes cada. A primeira coorte consiste em pacientes que se apresentam à Unidade Cardíaca com um IM agudo revascularizado com intervenção coronária percutânea (ICP), uma coorte que fornece informações valiosas sobre a forma como o fenótipo de DIC aguda é espelhado nos epitranscriptomas sanguíneos. Em segundo lugar, a principal coorte de estudo do projeto será formada por pacientes com fenótipo de DIC estável tratados com cirurgia de revascularização miocárdica (CABG) e oferece informações críticas a respeito de isquemia crônica e aterogênese coronariana, ambos processos em andamento no silencioso, ou seja, não diagnosticados, IHD. Em terceiro lugar, os pacientes destinados a uma terapia de substituição da válvula aórtica (RVA) devido a estenose sem DIC fornecem o grupo de controle positivo com uma patologia cardíaca diferente e, em quarto lugar, juntamente com os pacientes saudáveis ​​não DIC verificados com a tomografia computadorizada de coronária (CT ), formam as coortes de controle do projeto.

Amostras do estudo - O IHD-EPITRAN revela epitranscriptomas de RNA celular e livre de células das amostras de sangue TEMPUS(TM) e EDTA coletadas duas vezes, respectivamente. Além disso, para as coortes de IM e CABG, os epitranscriptomas das amostras de tecido do apêndice atrial direito são decifrados para um ponto de referência. Finalmente, um conjunto de biomarcadores complementares de HF e IHD: NT-proBNP, hsCRP, sST2 e TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 e Tibaut 2019) são medidos.

Métodos de RNA - O isolamento e fracionamento de RNA com métodos validados em laboratório são seguidos pela análise quantitativa de sete modificações de base utilizando um sistema de espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida de quadrupolo triplo UHPLC (Selberg 2019). Após a análise quantitativa, é realizada a pré-seleção de RNA baseada em anticorpo anti-m6A rica em marcas m6A em conjunto com o sequenciamento, ou seja, meRIP-seq. Por fim, após o UHPLC-LC-MS/MS e o meRIP-seq, o sequenciamento direto de nanoporos de leitura longa, permitindo a identificação das marcas m6A em suas sequências nativas, é realizado usando o algoritmo novo e recentemente desenvolvido por Liu et al. (2019). O algoritmo baseia-se no reconhecimento das interrupções características da corrente elétrica pelo m6A que flui através de nanoporos de proteínas específicas.

Sequenciamento de DNA - Para identificar os eventos de edição de RNA A-para-I, um sequenciamento de próxima geração do genoma inteiro é realizado para todos os participantes do estudo para permitir uma comparação de base de DNA-para-RNA correspondente (Park et al., 2012).

Bioinformática - Para interpretar os massivos conjuntos de dados gerados pelo sequenciamento, protocolos de bioinformática são desenvolvidos em colaboração com as equipes de bioinformática do Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) e da Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). As sequências são avaliadas contra bibliotecas de transcrições conhecidas.

Métodos clínicos - A ecocardiografia fornece informações sobre o estado funcional do coração e é realizada com parâmetros pré-especificados durante a internação inicial e 3 meses após ICP, CABG ou AVR. As consultas desses cardiologistas incluem a avaliação da gravidade da angina pectoris e da dispneia de esforço com as classificações CCS e NYHA, respectivamente. Além disso, está incluída a autoavaliação da morbidade com o Short Form 36 Health Survey. Além disso, uma pesquisa no sistema de registros de pacientes, incluindo internações, óbitos e alterações de medicamentos associáveis ​​à saúde cardiovascular, é coletada 6 meses antes e depois da operação.

Análise de poder - Os tamanhos de coorte foram determinados com a ferramenta web RNAseqPS projetada para avaliar poder estatístico para experimentos de RNAseq (Guo et al., 2014). Os valores dos parâmetros usados ​​(taxa de descoberta falsa [FDR] <0,05, número total de genes para testar 20.000, genes prognósticos previstos 1.500, limite mínimo de alteração de dobra 2 para expressão diferencial e contagens médias de leitura de 10 para genes prognósticos) foram derivados de um relatório sobre epitranscriptômica durante IC (Berulava et al., 2020). O valor de dispersão genética de prognóstico de 0,215 foi aplicado com base no artigo focado na questão de Yoon & Nam 2017, que analisou dispersões de dez conjuntos de dados RNA-seq disponíveis publicamente, quatro dos quais refletiam réplicas não relacionadas aplicáveis ​​para o IHD-EPITRAN com as dispersões variando entre 0,15 e 0,28.

Com base na análise de poder descrita acima, n=25 por coorte fornece poder suficiente (P≥0,95). Para lidar fluentemente com possíveis erros pré-analíticos, realizar validação subsequente e análises de acompanhamento, as coortes foram duplicadas.

Registros de pacientes

Os dados de informações de identificação de participantes individuais coletados durante o IHD-EPITRAN serão armazenados principalmente em formato elétrico nos discos rígidos de rede HUS e Tays que são protegidos por direitos de acesso baseados em função. Dois registros separados são criados para o IHD-EPITRAN: (1) Um registro de chaves, que contém todas as informações de identificação do participante e links entre os códigos de pseudônimos usados ​​no (2) Registro de pesquisa (totalmente pseudônimo) que contém todas as outras informações coletadas do estudo dos participantes. Antti Vento, diretor do IHD-EPITRAN, tem os direitos de acesso ao Registro de Chaves. Os registros são armazenados por 10 anos para possibilitar possíveis projetos de acompanhamento posterior.

Documentos de descrição de processamento para ambos os registros, juntamente com documentos de autoavaliação para os riscos do estudo, foram criados para o IHD-EPITRAN em finlandês. Esses documentos foram revisados ​​e aprovados pelo Conselho de Ética do Distrito Hospitalar de Helsinque e Uusimaa (Dnr. SUS/1211/2020).

Grupo de pesquisa

Docent Antti Vento é o diretor do projeto IHD-EPITRAN e do HUS Heart and Lung Center. A equipe interdisciplinar composta por médicos, pesquisadores básicos e especialistas analíticos permite que o IHD-EPITRAN realize sinergicamente o recrutamento, a coleta e a preparação de amostras, seguidos pelas análises bioinformáticas da paisagem epitranscriptômica do RNA circulante na IHD. Os docentes Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala e Satu Suihko, todos cardiologistas da estação cardíaca do HUS, farão o recrutamento dos pacientes de TC, análises de imagem, tratamento dos pacientes com infarto do miocárdio e, em terceiro lugar, consultas de controle dos pacientes com infarto do miocárdio, revascularização do miocárdio e AVR . A cirurgiã cardíaca e vascular Kari Teittinen do HUS Heart and Lung Center, juntamente com o cirurgião cardiotorácico Jahangir Khan PhD e o professor Jari Laurikka, ambos do Tays Heart Hospital, realizam o recrutamento dos pacientes de CABG e AVR e suas operações. As enfermeiras de pesquisa Kati Oksaharju e Kati Helleharju, do HUS Heart and Lung Center e do Tays Heart Hospital, respectivamente, coordenam o recrutamento de pacientes e, em estreita colaboração com a trabalhadora Lahja Eurajoki, a coleta de amostras, transporte e armazenamento imediato após o congelamento. O projeto será realizado no laboratório do docente Esko Kankuri e do professor Eero Mervaala (Universidade de Helsinque, Grupo CardioReg, Departamento de Farmacologia). BM Vilbert Sikorski e MSc Daria Blokhina realizarão de forma colaborativa isolamento de RNA, fracionamento, análise UHPLC-LC-MS/MS e formulação de artigo de protocolo. Além disso, Sikorski planejou o protocolo de estudo em colaboração com os outros coautores do IHD-EPITRAN, aplicou permissões de estudo e continua a coordenar a troca de informações entre os colaboradores e realiza a redação do artigo de resultados com os coautores.

Ética

Este estudo será conduzido de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de Ética do HUS (Dnr. SUS/1211/2020). Os respectivos conselhos regionais e nacionais avaliarão o protocolo subsequentemente para a coleta de amostras multicêntricas. Será tomado cuidado para que cada participante do estudo tenha tempo suficiente para se familiarizar com o protocolo do estudo. Posteriormente, uma discussão de consentimento informado será realizada e o consentimento informado por escrito obtido do participante.