Biomarcatori ematici epitrascrittomici per la malattia coronarica - Uno studio prospettico di coorte (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Sfondo - cardiopatia ischemica

Con una prevalenza globale di 126,5 milioni di persone e una mortalità annua di 8,9 milioni, la cardiopatia ischemica (IHD) è la principale causa di morte (GBD Collaborators 2017). L'IHD si sviluppa come risultato di un'aterogenesi in corso, un processo di accumulo di lipidi nelle pareti delle arterie coronarie. Alla fine, l'accumulo di colesterolo e calcio forma depositi, cioè placche, che restringono il lume del vaso. All'inizio dell'infarto miocardico (IM), una tale placca si rompe, il che porta alla morte anossica del miocardio, basandosi sull'afflusso di sangue del vaso. A breve termine, la funzione del cuore viene salvata dalla formazione di una cicatrice rigida. Nel corso del tempo, la funzione di pompaggio in genere si deteriora con conseguente insufficienza cardiaca (HF).

In modo ottimale, i biomarcatori della malattia vengono analizzati dal sangue e forniscono informazioni sulla progressione e sulla gravità della malattia e aiutano la valutazione dell'efficacia della terapia. Sfortunatamente, ad oggi non sono stati identificati biomarcatori ottimali per l'IHD. Il numero vasto ma incalcolabile di coloro che vivono con IHD non diagnosticata, beneficiando di una diagnosi precoce, sottolinea la necessità di un biomarcatore IHD.

Sfondo - Epitrascrittomica

L'epitranscriptomica, il campo delle modificazioni post-trascrizionali dell'RNA, analogo all'epigenetica del DNA, ha recentemente acquisito maggiore rilievo scientifico (Saletore 2012). Questo campo in espansione sta scoprendo un nuovo livello di regolazione biologica che controlla i processi che vanno dalla proliferazione cellulare alla morte.

Sebbene siano state identificate più di 170 modifiche dell'RNA nelle specie di RNA (Yang 2018), la metilazione dell'adenosina nella posizione dell'azoto-6 (m6A) si distingue come una delle più comuni e intensamente studiate (Liu 2020). Dopo le prime scoperte sugli mRNA metilati di m6A negli anni '70 (Desrosiers 1974), l'epitrascrittomica si è riaccesa solo nell'ultimo decennio con lo sviluppo di metodi affidabili in vivo per valutare l'm6A (Dominissini 2012). Queste prime metodologie basate sull'immunoprecipitazione (ad es. meRIP-seq) ha facilitato le scoperte degli specifici pattern di punteggiatura m6A e degli scrittori specificatamente denotati (metiltransferasi; complesso METTL3/14/WTAP1 e METTL16), lettori (proteine ​​leganti; ad es. famiglia di proteine ​​YTH) e cancellatori (demetilasi; ALKBH5; Zaccara 2019).

Sono stati identificati più lettori che mediano gli effetti m6A dalla famiglia di domini YTH. YTHDF1-3 promuove rispettivamente la traduzione, la degradazione o entrambi dell'mRNA. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 e ribosomi riconoscono anche m6A e promuovono la traduzione e la compartimentazione citoplasmatica (Zaccara 2019).

I cambiamenti nei livelli di m6A sono stati associati a numerose patologie, inclusi tumori, disturbi cardiovascolari e neurologici (Frye 2016). Gli studi che utilizzano sia il knockout che la sovraespressione dei writer e dei cancellatori m6A hanno rivelato il loro ruolo nel guidare la reattività immunitaria, la proliferazione cellulare, la migrazione e l'apoptosi (Delaunay 2019).

Background - Epitrascrittomica e cuore

Una serie di studi recentemente pubblicata suggerisce un ruolo sia per l'm6A che per l'editing A-to-I (adenosina-inosina, un'altra modifica comune che diversifica il trascrittoma alterando l'accoppiamento delle basi) durante l'ipertensione (Jain 2018), la neovascolarizzazione (Kwast 2019) , ipertrofia miocardica (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ischemia (Mathiyalagan 2019) e scompenso cardiaco (Berulava 2020). Mentre un corpo di prove indica che l'epitrascrittomica contribuisce alla salute e alle malattie cardiache, tutti gli studi iniziali si sono concentrati sul miocardio.

Motivazione, obiettivi e significato

Ipotizziamo che la fisiopatologia dell'IHD si rifletta nell'epitrascrittoma dell'RNA circolante. Ad esempio, l'RNA ribosomiale ha una lunga emivita e le sue modificazioni nella circolazione coronarica possono rispondere allo stato del cuore.

Gli obiettivi del progetto IHD-ERPITRAN sono: (1) stabilire protocolli di screening per i biomarcatori epitranscriptomici, (2) fornire informazioni epitranscriptomiche sulla patofisiologia dell'IHD, (3) identificare una serie di candidati biomarcatori IHD e (4) aprire strade per terapie sviluppo che in precedenza erano stati ignorati a causa della mancanza di ricerca e dei limiti metodologici. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riportato una scoperta di ligandi di piccole molecole per le RNA metiltransferasi (Selberg 2019).

Poiché è stato suggerito che l'epitranscrittomica svolga un ruolo normativo nel cuore e l'IHD-EPITRAN è tra i primi a valutare i biomarcatori ematici epitranscrittomici nell'IHD, il progetto detiene le chiavi per una svolta scientifica con benefici clinici globali prevedibili.

Metodi

Coorti di studio - 200 pazienti vengono reclutati in quattro coorti, contando 50 pazienti ciascuna. La prima coorte è costituita da pazienti che si presentano all'unità cardiaca con un infarto del miocardio acuto rivascolarizzato con intervento coronarico percutaneo (PCI), una coorte che fornisce preziose informazioni sul modo in cui il fenotipo IHD acuto si rispecchia negli epitrascrittomi del sangue. In secondo luogo, la coorte di studio principale del progetto sarà formata da pazienti con fenotipo IHD stabile trattati con innesto di bypass coronarico (CABG) e offre informazioni critiche rispetto all'ischemia cronica e all'aterogenesi coronarica, entrambi processi in corso nel silenzio, cioè non diagnosticati, IHD. In terzo luogo, i pazienti destinati a una terapia di sostituzione della valvola aortica (AVR) per stenosi senza IHD forniscono al gruppo di controllo positivo una diversa patologia cardiaca e, in quarto luogo, insieme ai pazienti sani non IHD verificati con la tomografia computerizzata coronarica (TC ), costituiscono le coorti di controllo del progetto.

Campioni di studio - L'IHD-EPITRAN scopre gli epitrascrittomi delle cellule del sangue e dell'RNA privo di cellule dai campioni di sangue TEMPUS(TM) e EDTA raccolti due volte, rispettivamente. Inoltre, per le coorti MI e CABG, gli epitrascrittomi dei campioni di tessuto dell'appendice atriale destra vengono decifrati per un punto di riferimento. Infine, viene misurata una serie di biomarcatori HF e IHD supplementari: NT-proBNP, hsCRP, sST2 e TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 e Tibaut 2019).

Metodi dell'RNA - L'isolamento e il frazionamento dell'RNA con metodi convalidati in laboratorio sono seguiti dall'analisi quantitativa di sette modifiche di base utilizzando un sistema UHPLC-cromatografia liquida a triplo quadrupolo-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Dopo l'analisi quantitativa, viene eseguita la preselezione dell'RNA basato su anticorpi anti-m6A ricco di segni m6A in tandem con il sequenziamento, ovvero meRIP-seq. In definitiva, dopo UHPLC-LC-MS/MS e meRIP-seq, il sequenziamento diretto a lettura lunga dei nanopori che consente l'identificazione dei segni m6A nelle loro sequenze native viene eseguito utilizzando il nuovo algoritmo sviluppato di recente da Liu et al. (2019). L'algoritmo si basa sul riconoscimento delle caratteristiche interruzioni della corrente elettrica da parte dell'm6A che scorre attraverso specifici nanopori proteici.

Sequenziamento del DNA - Al fine di identificare gli eventi di modifica dell'RNA da A a I, viene eseguito un sequenziamento di nuova generazione dell'intero genoma per tutti i partecipanti allo studio per consentire un confronto di basi DNA-RNA abbinato (Park et al., 2012).

Bioinformatica - Per interpretare gli enormi set di dati ottenuti dal sequenziamento, i protocolli di bioinformatica sono sviluppati in collaborazione con i team di bioinformatica del Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) e della Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). Le sequenze vengono valutate rispetto a librerie di trascrizioni note.

Metodi clinici - L'ecocardiografia fornisce informazioni sullo stato funzionale del cuore e viene eseguita con parametri pre-specificati sia durante il ricovero iniziale che 3 mesi dopo PCI, CABG o AVR. Gli appuntamenti di questi cardiologi includono la valutazione della gravità dell'angina pectoris e della dispnea da sforzo con gradi CCS e NYHA, rispettivamente. Inoltre, è inclusa l'autovalutazione della morbilità con la Short Form 36 Health Survey standardizzata. Inoltre, 6 mesi prima e dopo l'operazione, viene raccolta una ricerca nel sistema delle cartelle cliniche dei pazienti che include i ricoveri ospedalieri, i decessi e le modifiche terapeutiche associabili alla salute cardiovascolare.

Analisi della potenza - Le dimensioni della coorte sono state determinate con lo strumento web RNAseqPS progettato per valutare la potenza statistica per gli esperimenti RNAseq (Guo et al., 2014). I valori dei parametri utilizzati (false discovery rate [FDR] <0,05, numero totale di geni per il test 20.000, geni prognostici previsti 1500, soglia minima di modifica della piega 2 per l'espressione differenziale e conteggi medi di lettura di 10 per i geni prognostici) sono stati derivati ​​da un valore relazione riguardante l'epitrascrittomica durante lo scompenso cardiaco (Berulava et al., 2020). Il valore di dispersione genica prognostico di 0,215 è stato applicato sulla base dell'articolo incentrato sul problema di Yoon & Nam 2017, che ha analizzato le dispersioni da dieci set di dati RNA-seq pubblicamente disponibili, quattro dei quali riflettevano repliche non correlate applicabili per l'IHD-EPITRAN con le dispersioni che vanno tra 0,15 e 0,28.

Sulla base dell'analisi della potenza sopra descritta, n=25 per coorte fornisce una potenza sufficiente (P≥0,95). Per affrontare in modo fluido possibili errori preanalitici, eseguire successive analisi di validazione e follow-up, le coorti sono state raddoppiate.

Registri pazienti

I dati delle informazioni di identificazione dei singoli partecipanti raccolti durante l'IHD-EPITRAN saranno principalmente archiviati in forma elettronica sui dischi rigidi di rete di HUS e Tays che sono protetti da diritti di accesso basati sui ruoli. Per l'IHD-EPITRAN vengono creati due registri separati: (1) Un registro chiave, che contiene tutte le informazioni di identificazione dei partecipanti e i collegamenti tra i codici di pseudonimizzazione utilizzati nel (2) Registro di ricerca (completamente pseudonimizzato) che contiene tutte le altre informazioni di studio raccolte dai partecipanti. Antti Vento, direttore dell'IHD-EPITRAN, ha i diritti di accesso al Key Registry. I registri vengono conservati per 10 anni per consentire eventuali successivi progetti di follow-up.

Per l'IHD-EPITRAN in finlandese sono stati creati documenti di descrizione dell'elaborazione per entrambi i registri, insieme a documenti di autovalutazione dei rischi dello studio. Questi documenti sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico del Distretto Ospedaliero di Helsinki e Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Gruppo di ricerca

Il Docent Antti Vento è il direttore sia del progetto IHD-EPITRAN che del HUS Heart and Lung Center. Il team interdisciplinare composto da clinici, ricercatori di base ed esperti analitici consente all'IHD-EPITRAN di eseguire sinergicamente il reclutamento, la raccolta e la preparazione dei campioni seguiti dalle analisi bioinformatiche del panorama epitrascrittomico dell'RNA circolante nell'IHD. I docenti Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala e Satu Suihko, tutti cardiologi della stazione cardiaca HUS, si occuperanno del reclutamento dei pazienti CT, delle analisi di imaging, del trattamento dei pazienti MI e, in terzo luogo, degli appuntamenti di controllo dei pazienti MI, CABG e AVR . Il cardiochirurgo e vascolare Kari Teittinen del HUS Heart and Lung Center, insieme al chirurgo cardiotoracico Jahangir Khan PhD e al professor Jari Laurikka, entrambi del Tays Heart Hospital, si occupano del reclutamento dei pazienti CABG e AVR e delle loro operazioni. Le infermiere ricercatrici Kati Oksaharju e Kati Helleharju, rispettivamente del HUS Heart and Lung Center e del Tays Heart Hospital, coordinano il reclutamento dei pazienti e, in stretta collaborazione con la laboriosa Lahja Eurajoki, la raccolta, il trasporto e la pronta conservazione dei campioni dopo il congelamento. Il progetto sarà svolto nel laboratorio del docente Esko Kankuri e del professor Eero Mervaala (Università di Helsinki, Gruppo CardioReg, Dipartimento di Farmacologia). BM Vilbert Sikorski e MSc Daria Blokhina, eseguiranno in collaborazione l'isolamento dell'RNA, il frazionamento, l'analisi UHPLC-LC-MS/MS e la formulazione dell'articolo del protocollo. Inoltre, Sikorski ha pianificato in modo collaborativo il protocollo di studio con gli altri coautori di IHD-EPITRAN, ha applicato i permessi di studio e continua a coordinare lo scambio di informazioni tra i collaboratori e svolge la scrittura di articoli sui risultati con i coautori.

Etica

Questo studio sarà condotto in conformità con il protocollo approvato dal Comitato Etico HUS (Dnr. HUS/1211/2020). I rispettivi consigli regionali e nazionali valuteranno successivamente il protocollo per la raccolta di campioni multicentrici. Verrà prestata attenzione affinché ogni partecipante allo studio abbia tempo sufficiente per familiarizzare con il protocollo dello studio. Successivamente, si terrà una discussione sul consenso informato e il consenso informato scritto sarà ottenuto dal partecipante.