Epitranskriptomické krevní biomarkery pro onemocnění koronárních tepen – prospektivní kohortová studie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Pozadí - Ischemická choroba srdeční

S celosvětovou prevalencí 126,5 milionu lidí a roční úmrtností 8,9 milionu je ischemická choroba srdeční (ICHS) hlavní příčinou úmrtí (GBD Collaborators 2017). IHD se rozvíjí jako výsledek probíhající aterogeneze, procesu hromadění lipidů ve stěnách koronárních tepen. Nakonec akumulace cholesterolu a vápníku tvoří usazeniny, tj. plaky, které zužují průsvit cévy. Při nástupu infarktu myokardu (IM) takový plát praskne, což vede k anoxické smrti myokardu v závislosti na prokrvení cévy. Krátkodobě je funkce srdce zachráněna vytvořením tuhé jizvy. V průběhu času se funkce pumpování typicky zhoršuje s následným srdečním selháním (HF).

V optimálním případě jsou biomarkery onemocnění analyzovány z krve a poskytují pohled na progresi onemocnění, jeho závažnost a pomáhají při hodnocení účinnosti terapie. Bohužel dosud nebyly identifikovány optimální biomarkery pro IHD. Obrovský, ale nespočítaný počet lidí žijících s nediagnostikovanou ICHS, kteří těží z včasné diagnózy, podtrhuje potřebu biomarkeru ICHS.

Pozadí - Epitranskriptomika

Epitranskriptomika, obor posttranskripčních modifikací RNA, obdoba epigenetiky DNA, získává v poslední době více vědeckých poznatků (Saletore 2012). Toto rozšiřující se pole odkrývá novou vrstvu biologické regulace, která řídí procesy od buněčné proliferace až po smrt.

Ačkoli bylo u druhů RNA identifikováno více než 170 modifikací RNA (Yang 2018), methylace adenosinu na pozici dusíku-6 (m6A) vyniká jako jedna z nejčastějších a intenzivně studovaných (Liu 2020). Po počátečních zjištěních m6A metylovaných mRNA v 70. letech 20. století (Desrosiers 1974) se epitranskriptomika znovu rozhořela až v posledním desetiletí s rozvojem spolehlivých in vivo metod pro hodnocení m6A (Dominissini 2012). Tyto časné metodologie založené na imunoprecipitaci (tj. meRIP-seq) usnadnil objevy specifických interpunkčních vzorů m6A a specificky označovaných zapisovačů (methyltransferázy; komplex METTL3/14/WTAP1 a METTL16), čtečky (vazebné proteiny; např. rodina proteinů YTH) a gumy (demethylázy; ALKBH5; Zaccara 2019).

Bylo identifikováno několik čteček zprostředkovávajících efekty m6A z rodiny domén YTH. YTHDF1-3 podporuje translaci mRNA, degradaci nebo obojí. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 a ribozomy rozpoznávají také m6A a podporují translaci a cytoplazmatickou kompartmentalizaci (Zaccara 2019).

Změny v hladinách m6A byly spojeny s řadou patologií, včetně rakoviny, kardiovaskulárních a neurologických poruch (Frye 2016). Studie využívající jak knockout, tak nadměrnou expresi m6A spisovatelů a mazadel odhalily jejich roli při řízení imunitní reaktivity, buněčné proliferace, migrace a apoptózy (Delaunay 2019).

Pozadí - Epitranskriptomika a srdce

Nedávno publikovaný soubor studií naznačuje roli editace m6A i A-to-I (adenosin-to-inosin, další běžná modifikace diverzifikující transkriptom změnou párování bází) během hypertenze (Jain 2018), neovaskularizace (Kwast 2019) , hypertrofie myokardu (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ischemie (Mathiyalagan 2019) a HF (Berulava 2020). Zatímco řada důkazů naznačuje, že epitranskriptomika přispívá ke zdraví a onemocnění srdce, všechny počáteční studie se zaměřily na myokard.

Odůvodnění, cíle a význam

Předpokládáme, že patofyziologie IHD se odráží v epitranskriptomu cirkulující RNA. Například ribozomální RNA má dlouhý poločas a její modifikace v koronárním oběhu mohou reagovat na stav srdce.

Cíle projektu IHD-ERPITRAN jsou: (1) zavést screeningové protokoly pro epitranskriptomické biomarkery, (2) poskytnout epitranskriptomický pohled na patofyziologii ICHS, (3) identifikovat sadu kandidátů na biomarkery IHD a (4) otevřít cesty pro terapeutické vývoj, který byl dříve přehlížen kvůli nedostatku výzkumu a metodologickým omezením. Například naše výzkumná skupina oznámila objev ligandů s malou molekulou pro RNA methyltransferázy (Selberg 2019).

Vzhledem k tomu, že se předpokládá, že epitranskriptomika hraje regulační roli v srdci a IHD-EPITRAN je jedním z prvních, který hodnotí epitranskriptomické krevní biomarkery u ICHS, projekt je klíčem k vědeckému průlomu s očekávanými globálními klinickými přínosy.

Metody

Studované kohorty - 200 pacientů bylo vybráno do čtyř kohort, každá čítající 50 pacientů. První kohorta se skládá z pacientů přicházejících na srdeční jednotku s akutním infarktem myokardu revaskularizovaným perkutánní koronární intervencí (PCI), což je kohorta, která poskytuje cenný pohled na způsob, jakým se akutní fenotyp ICHS odráží v krevních epitranskriptomech. Zadruhé, hlavní studijní kohorta projektu bude tvořena pacienty se stabilním fenotypem ICHS léčených bypassem koronární artérie (CABG) a nabízí kritické informace s ohledem na chronickou ischemii a koronární aterogenezi, oba probíhající procesy v tiché, tj. nediagnostikované, IHD. Za třetí, pacienti určení k léčbě náhrady aortální chlopně (AVR) kvůli stenóze bez ICHS poskytují pozitivní kontrolní skupinu s odlišnou srdeční patologií a za čtvrté, spolu se zdravými pacienty bez ICHS verifikovaní pomocí koronární počítačové tomografie (CT ), tvoří kontrolní kohorty projektu.

Studijní vzorky - IHD-EPITRAN odhaluje krevní buněčné a bezbuněčné RNA epitranskriptomy z dvakrát odebraných krevních vzorků TEMPUS™ a EDTA. Navíc u kohort s MI a CABG jsou jako referenční bod dešifrovány epitranskriptomy ze vzorků tkáně ouška pravé síně. Nakonec je měřena sada doplňkových biomarkerů HF a IHD: NT-proBNP, hsCRP, sST2 a TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 a Tibaut 2019).

Metody RNA - Po izolaci a frakcionaci RNA laboratorně ověřenými metodami následuje kvantitativní analýza sedmi modifikací bází pomocí systému UHPLC-triple quadrupole kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Po kvantitativní analýze se provede předvýběr RNA na bázi anti-m6A protilátky bohatý na značky m6A v tandemu se sekvenováním, tj. meRIP-seq. Nakonec, po UHPLC-LC-MS/MS a meRIP-seq, se pomocí nového a nedávno vyvinutého algoritmu Liu et al. (2019). Algoritmus je založen na rozpoznání charakteristických poruch elektrického proudu m6A protékajícího specifickými proteinovými nanopóry.

Sekvenování DNA – Aby bylo možné identifikovat události úprav RNA A-to-I, je u všech účastníků studie provedeno sekvenování celé genomu nové generace, aby bylo možné porovnávat báze mezi DNA a RNA (Park et al., 2012).

Bioinformatika – za účelem interpretace masivních datových souborů získaných sekvenováním jsou bioinformatické protokoly vyvíjeny ve spolupráci s bioinformatickými týmy z Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) a Middle East Technical University (profesor Nurcan Tuncbag). Sekvence jsou hodnoceny proti známým transkriptovým knihovnám.

Klinické metody - Echokardiografie poskytuje náhled na funkční stav srdce a je prováděna s předem stanovenými parametry jak během vstupní hospitalizace, tak 3 měsíce po PCI, CABG nebo AVR. Schůzky těchto kardiologů zahrnují posouzení závažnosti anginy pectoris a námahové dušnosti s CCS a NYHA stupněm, v daném pořadí. Kromě toho je zahrnuto sebehodnocení nemocnosti pomocí standardizovaného krátkého dotazníku 36 Health Survey. Kromě toho se 6 měsíců před a po operaci shromažďuje systém vyhledávání záznamů pacientů včetně přijetí do nemocnice, úmrtí a změn léků souvisejících s kardiovaskulárním zdravím.

Analýza síly - Velikosti kohort byly stanoveny pomocí webového nástroje RNAseqPS navrženého pro vyhodnocení statistické síly pro experimenty RNAseq (Guo et al., 2014). Použité hodnoty parametrů (míra falešného objevu [FDR] <0,05, celkový počet genů pro testování 20 000, predikované prognostické geny 1500, minimální práh změny 2 pro diferenciální expresi a průměrný počet čtení 10 pro prognostické geny) byly odvozeny z použitelné zpráva týkající se epitranskriptomiky během srdečního selhání (Berulava et al., 2020). Prognostická hodnota disperze genu 0,215 byla aplikována na základě článku zaměřeného na problém od Yoon & Nam 2017, který analyzoval disperze z deseti veřejně dostupných datových sad RNA-seq, z nichž čtyři odrážely nesouvisející repliky použitelné pro IHD-EPITRAN s rozptylem v rozmezí mezi 0,15 a 0,28.

Na základě analýzy síly popsané výše, n=25 na kohortu poskytuje dostatečný výkon (P≥0,95). Aby bylo možné plynule řešit možné preanalytické chyby, provést následnou validaci a následné analýzy, byly kohorty zdvojnásobeny.

Registry pacientů

Identifikační údaje jednotlivých účastníků shromážděné během IHD-EPITRAN budou převážně uloženy v elektrické formě na síťové pevné disky HUS a Tays, které jsou chráněny přístupovými právy na základě rolí. Pro IHD-EPITRAN jsou vytvořeny dva samostatné registry: (1) Registr klíčů, který obsahuje všechny identifikační informace účastníků a vazby mezi pseudonymizačními kódy, které se používají ve (2) Registru výzkumu (plně pseudonymizovaný), který obsahuje všechny ostatní shromážděné informace o studii. od účastníků. Antti Vento, ředitel IHD-EPITRAN, má přístupová práva k registru klíčů. Registry jsou uchovávány po dobu 10 let, aby byly umožněny případné pozdější navazující projekty.

Pro IHD-EPITRAN ve finštině byly vytvořeny zpracovací popisné dokumenty pro oba registry, spolu s dokumentem sebehodnocení rizik studie. Tyto dokumenty byly přezkoumány a schváleny Etickou radou nemocniční čtvrti Helsinky a Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Výzkumná skupina

Docent Antti Vento je ředitelem jak projektu IHD-EPITRAN, tak Srdečního a plicního centra HUS. Interdisciplinární tým složený z klinických lékařů, základních výzkumníků a analytických odborníků umožňuje IHD-EPITRAN synergicky provádět nábor, odběr vzorků a přípravu s následnou bioinformatickou analýzou epitranskriptomické krajiny cirkulující RNA v IHD. Docenti Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala a Satu Suihko, všichni kardiologové ze srdeční stanice HUS, budou provádět nábor pacientů na CT, zobrazovací analýzy, léčbu pacientů s MI a zatřetí kontroly pacientů s MI, CABG a AVR. . Srdeční a cévní chirurg Kari Teittinen ze Srdečního a plicního centra HUS spolu s kardiotorakálním chirurgem Jahangirem Khanem PhD a profesorem Jari Laurikkou, oba z Tays Heart Hospital, provádějí nábor pacientů CABG a AVR a jejich operace. Výzkumné sestry Kati Oksaharju a Kati Helleharju z HUS Heart and Lung Center a Tays Heart Hospital, v tomto pořadí, koordinují nábor pacientů a v úzké spolupráci s laborantkou Lahja Eurajoki odběr vzorků, transport a rychlé skladování po zmrazení. Projekt bude realizován v laboratoři docenta Eska Kankuriho a profesora Eera Mervaaly (Univerzita v Helsinkách, CardioReg Group, Katedra farmakologie). B.M. Vilbert Sikorski a MSc Daria Blokhina budou společně provádět izolaci RNA, frakcionaci, analýzu UHPLC-LC-MS/MS a formulaci článku podle protokolu. Kromě toho Sikorski ve spolupráci naplánoval protokol studie s ostatními spoluautory IHD-EPITRAN, použil studijní povolení a pokračuje v koordinaci výměny informací mezi spolupracovníky a se spoluautory provádí psaní článků o výsledcích.

Etika

Tato studie bude provedena v souladu s protokolem schváleným Etickou radou HUS (Dnr. HUS/1211/2020). Příslušné regionální a národní komise protokol následně vyhodnotí pro multicentrický odběr vzorků. Bude dbáno na to, aby každý účastník studie měl dostatek času na seznámení se s protokolem studie. Poté proběhne diskuse o informovaném souhlasu a od účastníka bude získán písemný informovaný souhlas.