Epitranskriptomische Blut-Biomarker für koronare Herzkrankheit – eine prospektive Kohortenstudie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Hintergrund - Ischämische Herzkrankheit

Mit einer weltweiten Prävalenz von 126,5 Millionen Menschen und einer jährlichen Sterblichkeit von 8,9 Millionen ist die ischämische Herzkrankheit (IHD) die häufigste Todesursache (GBD Collaborators 2017). IHD entwickelt sich als Ergebnis einer andauernden Atherogenese, einem Prozess der Ansammlung von Lipiden in den Wänden der Koronararterien. Schließlich bilden sich durch die Ansammlung von Cholesterin und Kalzium Ablagerungen, also Plaques, die die Gefäßlumen verengen. Zu Beginn eines Myokardinfarkts (MI) platzt eine solche Plaque, was zu einem anoxischen Tod des Myokards führt, das auf die Blutversorgung des Gefäßes angewiesen ist. Kurzfristig wird die Herzfunktion durch die Bildung einer steifen Narbe gerettet. Im Laufe der Zeit verschlechtert sich die Pumpfunktion typischerweise mit nachfolgender Herzinsuffizienz (HF).

Optimalerweise werden Krankheitsbiomarker aus dem Blut analysiert und geben sowohl Aufschluss über Krankheitsverlauf und -schwere als auch zur Bewertung der Therapiewirksamkeit. Leider wurden bis heute keine optimalen Biomarker für IHD identifiziert. Die große, aber ungezählte Zahl von Menschen, die mit nicht diagnostizierter IHD leben und von einer frühen Diagnose profitieren, unterstreicht die Notwendigkeit eines IHD-Biomarkers.

Hintergrund - Epitranskriptomik

Epitranskriptomik, das Gebiet der posttranskriptionellen Modifikationen von RNA, analog zur DNA-Epigenetik, hat in letzter Zeit mehr wissenschaftliche Beachtung gefunden (Saletore 2012). Dieses expandierende Gebiet deckt eine neue Ebene der biologischen Regulation auf, die Prozesse steuert, die von der Zellproliferation bis zum Tod reichen.

Obwohl mehr als 170 RNA-Modifikationen in RNA-Spezies identifiziert wurden (Yang 2018), sticht die Adenosin-Methylierung an der Stickstoff-6-Position (m6A) als eine der häufigsten und am intensivsten untersuchten hervor (Liu 2020). Nach den ersten Erkenntnissen über m6A-methylierte mRNAs in den 1970er Jahren (Desrosiers 1974) hat die Epitranskriptomik erst im letzten Jahrzehnt mit der Entwicklung zuverlässiger In-vivo-Methoden zur Bewertung von m6A (Dominissini 2012) wiederbelebt. Diese frühen auf Immunpräzipitation basierenden Methoden (d. h. meRIP-seq) erleichterte die Entdeckung der spezifischen m6A-Interpunktionsmuster und der spezifisch bezeichneten Writer (Methyltransferasen; METTL3/14/WTAP1-Komplex und METTL16), Reader (Bindungsproteine; z. YTH-Proteinfamilie) und Radiergummis (Demethylasen; ALKBH5; Zaccara 2019).

Es wurden mehrere Reader identifiziert, die die m6A-Effekte aus der YTH-Domänenfamilie vermitteln. YTHDF1-3 fördern die mRNA-Translation, den Abbau oder beides. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 und Ribosomen erkennen ebenfalls m6A und fördern die Translation und zytoplasmatische Kompartimentierung (Zaccara 2019).

Veränderungen der m6A-Spiegel wurden mit zahlreichen Pathologien in Verbindung gebracht, darunter Krebs, kardiovaskuläre und neurologische Störungen (Frye 2016). Studien, in denen sowohl Knockout als auch Überexpression der m6A-Schreiber und -Radierer verwendet wurden, haben ihre Rolle bei der Förderung der Immunreaktivität, Zellproliferation, Migration und Apoptose aufgezeigt (Delaunay 2019).

Hintergrund - Epitranskriptomik & Herz

Eine kürzlich veröffentlichte Reihe von Studien legt nahe, dass sowohl die m6A- als auch die A-zu-I-Bearbeitung (Adenosin-zu-Inosin, eine weitere häufige Modifikation, die das Transkriptom durch Veränderung der Basenpaarung diversifiziert) eine Rolle bei Bluthochdruck (Jain 2018), Neovaskularisation (Kwast 2019) spielen. , Myokardhypertrophie (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), Ischämie (Mathiyalagan 2019) und Herzinsuffizienz (Berulava 2020). Während eine Reihe von Beweisen darauf hindeuten, dass Epitranskriptomik einen Beitrag zur Herzgesundheit und -krankheit leistet, konzentrierten sich alle ersten Studien auf das Myokard.

Begründung, Ziele und Bedeutung

Wir nehmen an, dass sich die Pathophysiologie der IHD im Epitranskriptom der zirkulierenden RNA widerspiegelt. Beispielsweise hat ribosomale RNA eine lange Halbwertszeit und ihre Modifikationen im Koronarkreislauf können auf den Zustand des Herzens reagieren.

Die Ziele des IHD-ERPITRAN-Projekts sind: (1) Erstellung von Screening-Protokollen für epitranskriptomische Biomarker, (2) Bereitstellung epitranskriptomischer Einblicke in die IHD-Pathophysiologie, (3) Identifizierung einer Reihe von IHD-Biomarkerkandidaten und (4) Eröffnung von Therapiemöglichkeiten Entwicklungen, die bisher aufgrund mangelnder Forschung und methodischer Limitationen vernachlässigt wurden. Beispielsweise hat unsere Forschungsgruppe über eine Entdeckung von niedermolekularen Liganden für RNA-Methyltransferasen berichtet (Selberg 2019).

Da vorgeschlagen wurde, dass Epitranskriptomik eine regulatorische Rolle im Herzen spielt, und das IHD-EPITRAN zu den ersten gehört, die epitranskriptomische Blutbiomarker bei IHD evaluieren, hält das Projekt den Schlüssel für einen wissenschaftlichen Durchbruch mit erwartbarem globalen klinischen Nutzen bereit.

Methoden

Studienkohorten – 200 Patienten werden in vier Kohorten mit jeweils 50 Patienten rekrutiert. Die erste Kohorte besteht aus Patienten, die sich in der Herzstation mit einem akuten MI vorstellen, der mit einer perkutanen Koronarintervention (PCI) revaskularisiert wurde, einer Kohorte, die wertvolle Einblicke in die Art und Weise gibt, wie sich der akute IHD-Phänotyp in den Blutepitranskriptomen widerspiegelt. Zweitens wird die Hauptstudienkohorte des Projekts aus Patienten mit stabilem IHD-Phänotyp gebildet, die mit Koronararterien-Bypass-Operation (CABG) behandelt wurden, und bietet wichtige Informationen in Bezug auf chronische Ischämie und koronare Atherogenese, beides laufende Prozesse im stillen, d. h. nicht diagnostizierten, IHD. Drittens stellen Patienten, die für eine Aortenklappenersatztherapie (AVR) aufgrund einer Stenose ohne IHD bestimmt sind, die positive Kontrollgruppe mit einer abweichenden Herzpathologie dar, und viertens stellen zusammen mit den gesunden Patienten ohne IHD, die mit der koronaren Computertomographie (CT ), bilden die Kontrollkohorten des Vorhabens.

Studienproben - Das IHD-EPITRAN deckt zelluläre und zellfreie RNA-Epitranskriptome des Blutes aus den zweimal entnommenen TEMPUS(TM)- bzw. EDTA-Blutproben auf. Darüber hinaus werden für MI- und CABG-Kohorten die Epitranskriptome aus den Gewebeproben des rechten Vorhofohrs als Bezugspunkt entschlüsselt. Schließlich wird eine Reihe ergänzender HF- und IHD-Biomarker gemessen: NT-proBNP, hsCRP, sST2 und TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 und Tibaut 2019).

RNA-Methoden – Auf die RNA-Isolierung und -Fraktionierung mit im Labor validierten Methoden folgt die quantitative Analyse von sieben Basenmodifikationen unter Verwendung eines UHPLC-Triple-Quadrupol-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Systems (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Nach der quantitativen Analyse wird eine Anti-m6A-Antikörper-basierte RNA-Vorauswahl mit vielen m6A-Markierungen zusammen mit der Sequenzierung, d. h. meRIP-seq, durchgeführt. Letztendlich wird nach UHPLC-LC-MS/MS und meRIP-seq eine direkte Nanoporen-Long-Read-Sequenzierung durchgeführt, die die Identifizierung der m6A-Markierungen in ihren nativen Sequenzen ermöglicht, wobei der neuartige und kürzlich entwickelte Algorithmus von Liu et al. (2019). Der Algorithmus basiert auf der Erkennung der charakteristischen Unterbrechungen des elektrischen Stroms durch das m6A, das durch spezifische Protein-Nanoporen fließt.

DNA-Sequenzierung – Um die A-zu-I-RNA-Editing-Ereignisse zu identifizieren, wird für alle Studienteilnehmer eine Sequenzierung des gesamten Genoms der nächsten Generation durchgeführt, um einen übereinstimmenden DNA-zu-RNA-Basenvergleich zu ermöglichen (Park et al., 2012).

Bioinformatik – Um die massiven Datensätze aus der Sequenzierung zu interpretieren, werden Bioinformatikprotokolle in Zusammenarbeit mit den Bioinformatikteams von Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) und der Middle East Technical University (Professor Nurcan Tuncbag) entwickelt. Die Sequenzen werden gegen bekannte Transkriptbibliotheken bewertet.

Klinische Methoden - Die Echokardiographie gibt Einblick in den Funktionszustand des Herzens und wird mit vorab festgelegten Parametern sowohl während des anfänglichen Krankenhausaufenthalts als auch 3 Monate nach entweder PCI, CABG oder AVR durchgeführt. Diese Kardiologentermine umfassen die Schweregradbeurteilung von Angina pectoris und Belastungsdyspnoe mit CCS- bzw. NYHA-Einstufung. Zusätzlich ist eine Morbiditätsselbstauskunft mit dem standardisierten Short Form 36 Health Survey enthalten. Darüber hinaus wird 6 Monate vor und nach der Operation eine Suche im Patientenaktensystem durchgeführt, die Krankenhauseinweisungen, Todesfälle und Medikationsänderungen im Zusammenhang mit der kardiovaskulären Gesundheit enthält.

Power-Analyse – Die Kohortengrößen wurden mit dem RNAseqPS-Webtool bestimmt, das zur Bewertung der statistischen Power für RNAseq-Experimente entwickelt wurde (Guo et al., 2014). Die verwendeten Parameterwerte (False-Discovery-Rate [FDR] < 0,05, Gesamtzahl der zu testenden Gene 20.000, vorhergesagte prognostische Gene 1.500, Minimum-Fold-Change-Schwellenwert 2 für differenzielle Expression und durchschnittliche Lesezahlen von 10 für prognostische Gene) wurden von einem anwendbaren abgeleitet Bericht über Epitranskriptomik während Herzinsuffizienz (Berulava et al., 2020). Der prognostische Genstreuungswert von 0,215 wurde basierend auf dem Artikel von Yoon & Nam 2017 zu diesem Thema angewendet, in dem Streuungen aus zehn öffentlich verfügbaren RNA-seq-Datensätzen analysiert wurden, von denen vier nicht verwandte Replikationen widerspiegelten, die für das IHD-EPITRAN mit unterschiedlichen Streuungen anwendbar waren zwischen 0,15 und 0,28.

Basierend auf der oben beschriebenen Leistungsanalyse bieten n=25 pro Kohorte eine ausreichende Leistung (P≥0,95). Um mögliche präanalytische Fehler fließend anzugehen, anschließende Validierungen und Folgeanalysen durchzuführen, wurden die Kohorten verdoppelt.

Patientenregister

Die während des IHD-EPITRAN gesammelten individuellen Teilnehmeridentifikationsdaten werden hauptsächlich in elektrischer Form auf den Netzwerkfestplatten von HUS und Tays gespeichert, die durch rollenbasierte Zugriffsrechte geschützt sind. Für das IHD-EPITRAN werden zwei separate Register erstellt: (1) Ein Schlüsselregister, das alle Teilnehmeridentifikationsinformationen und Verknüpfungen zwischen Pseudonymisierungscodes enthält, die im (2) Forschungsregister (vollständig pseudonymisiert) verwendet werden, das alle anderen gesammelten Studieninformationen enthält von den Teilnehmern. Antti Vento, der Direktor des IHD-EPITRAN, hat die Zugangsrechte zum Key Registry. Die Register werden für 10 Jahre gespeichert, um eventuelle spätere Folgeprojekte zu ermöglichen.

Verarbeitungsbeschreibungsdokumente für beide Register wurden zusammen mit dem Selbstbewertungsdokument für die Risiken der Studie für das IHD-EPITRAN auf Finnisch erstellt. Diese Dokumente wurden von der Ethikkommission des Krankenhausbezirks Helsinki und Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Forschungsgruppe

Dozent Antti Vento ist Direktor sowohl des IHD-EPITRAN-Projekts als auch des HUS-Herz- und Lungenzentrums. Das interdisziplinäre Team aus Klinikern, Grundlagenforschern und Analyseexperten ermöglicht es dem IHD-EPITRAN, die Rekrutierung, Probenentnahme und -vorbereitung, gefolgt von den bioinformatischen Analysen der epitranskriptomischen Landschaft der zirkulierenden RNA in IHD, synergetisch durchzuführen. Die Dozenten Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala und Satu Suihko, alle Kardiologen der HUS-Herzstation, werden die Rekrutierung der CT-Patienten, Bildanalysen, die Behandlung der MI-Patienten und drittens die Kontrolltermine der MI-, CABG- und AVR-Patienten durchführen . Der Herz- und Gefäßchirurg Kari Teittinen vom HUS Heart and Lung Center führt zusammen mit dem Herz-Thorax-Chirurgen Jahangir Khan PhD und Professor Jari Laurikka, beide vom Tays Heart Hospital, die Rekrutierung der CABG- und AVR-Patienten und deren Operationen durch. Die Forschungsschwestern Kati Oksaharju und Kati Helleharju vom HUS Heart and Lung Center bzw. vom Tays Heart Hospital koordinieren die Patientenrekrutierung und in enger Zusammenarbeit mit der Laborantin Lahja Eurajoki die Probenentnahme, den Transport und die sofortige Lagerung nach dem Einfrieren. Das Projekt wird im Labor von Dozent Esko Kankuri und Professor Eero Mervaala (Universität Helsinki, CardioReg Group, Institut für Pharmakologie) durchgeführt. BM Vilbert Sikorski und MSc Daria Blokhina werden gemeinsam die RNA-Isolierung, Fraktionierung, UHPLC-LC-MS/MS-Analyse und Protokollartikelformulierung durchführen. Darüber hinaus hat Sikorski gemeinsam mit den anderen IHD-EPITRAN-Co-Autoren das Studienprotokoll geplant, Studiengenehmigungen beantragt und koordiniert weiterhin den Informationsaustausch zwischen den Mitarbeitern und führt mit den Co-Autoren das Verfassen von Ergebnisartikeln durch.

Ethik

Diese Studie wird in Übereinstimmung mit dem vom HUS-Ethikausschuss genehmigten Protokoll (Dnr. HUS/1211/2020). Die jeweiligen regionalen und nationalen Gremien werden das Protokoll anschließend für die multizentrische Probenentnahme bewerten. Es wird darauf geachtet, dass jeder Studienteilnehmer ausreichend Zeit hat, sich mit dem Studienprotokoll vertraut zu machen. Danach wird ein Aufklärungsgespräch geführt und die schriftliche Einwilligung des Teilnehmers eingeholt.