Sepelvaltimotaudin epitranskriptomiset veren biomarkkerit – Prospektiivinen kohorttitutkimus (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Tausta - iskeeminen sydänsairaus

Maailmanlaajuisesti 126,5 miljoonan ihmisen esiintyvyys ja 8,9 miljoonan vuotuinen kuolleisuus, iskeeminen sydänsairaus (IHD) on yleisin kuolinsyy (GBD Colaborators 2017). IHD kehittyy meneillään olevan aterogeneesin seurauksena, eli sepelvaltimoiden seinämiin kerääntyy lipidejä. Lopulta kolesterolin ja kalsiumin kerääntyminen muodostaa saostumia, eli plakkeja, jotka kaventavat suonen valoa. Sydäninfarktin (MI) alkaessa tällainen plakki repeytyy, mikä johtaa sydänlihaksen hapettomaan kuolemaan verisuonen verenkiertoon perustuen. Lyhyellä aikavälillä sydämen toiminta pelastuu muodostamalla jäykkä arpi. Ajan myötä pumppaustoiminto tyypillisesti heikkenee seuranneen sydämen vajaatoiminnan (HF) seurauksena.

Optimaalisesti sairauden biomarkkerit analysoidaan verestä, ja ne antavat sekä käsityksen taudin etenemisestä, vakavuudesta että auttavat arvioimaan hoidon tehokkuutta. Valitettavasti IHD:n optimaalisia biomarkkereita ei ole toistaiseksi tunnistettu. Varhaisesta diagnoosista hyötyvien, diagnosoimattoman IHD:n valtava, mutta lukematon määrä korostaa IHD-biomarkkerin tarvetta.

Taustaa - epitranskriptomiikka

Epitrankriptomiikka, RNA:n transkription jälkeisten modifikaatioiden ala, joka on analoginen DNA:n epigenetiikan kanssa, on saanut viime aikoina enemmän tieteellistä huomiota (Saletore 2012). Tämä laajentuva kenttä paljastaa uuden kerroksen biologista säätelyä, joka ohjaa prosesseja solujen lisääntymisestä kuolemaan.

Vaikka RNA-lajeista on tunnistettu yli 170 RNA-modifikaatiota (Yang 2018), adenosiinin metylaatio typpi-6-asemassa (m6A) erottuu yhdeksi yleisimmistä ja intensiivisimmin tutkituista (Liu 2020). M6A-metyloituneiden mRNA:iden 1970-luvulla tehtyjen ensimmäisten löydösten (Desrosiers 1974) jälkeen epitranskriptomiikka on herännyt uudelleen voimaan vasta viimeisen vuosikymmenen aikana, kun on kehitetty luotettavia in vivo -menetelmiä m6A:n arvioimiseksi (Dominissini 2012). Nämä varhaiset immunosaostukseen perustuvat menetelmät (ts. meRIP-seq) helpotti spesifisten m6A-välimerkkien ja erityisesti merkittyjen kirjoittajien (metyylitransferaasit; METTL3/14/WTAP1-kompleksi ja METTL16), lukijoiden (sitovia proteiineja; esim. YTH-proteiiniperhe) ja pyyhekumit (demetylaasit; ALKBH5; Zaccara 2019).

Useita lukijoita, jotka välittävät m6A-vaikutuksia YTH-verkkoalueperheestä, on tunnistettu. YTHDF1-3 edistävät mRNA:n translaatiota, hajoamista tai molempia, vastaavasti. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 ja ribosomit tunnistavat myös m6A:n ja edistävät translaatiota ja sytoplasmaa lokeroitumista (Zaccara 2019).

Muutokset m6A-tasoissa on yhdistetty lukuisiin patologioihin, kuten syöpiin, sydän- ja verisuonisairauksiin ja neurologisiin häiriöihin (Frye 2016). Tutkimukset, joissa käytettiin sekä m6A-kirjoittajien ja pyyhekumien poistamista että yli-ilmentymistä, ovat paljastaneet niiden roolin immuunireaktiivisuuden, solujen lisääntymisen, migraation ja apoptoosin edistämisessä (Delaunay 2019).

Taustaa - epitranskriptomiikka ja sydän

Äskettäin julkaistu tutkimussarja ehdottaa roolia sekä m6A- että A-to-I-muokkauksilla (adenosiinista inosiiniksi, toinen yleinen muunnos, joka monipuolistaa transkriptiota muuttamalla emäsparia) verenpainetaudin (Jain 2018), uudissuonittumisen (Kwast 2019) aikana. , sydänlihaksen hypertrofia (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), iskemia (Mathiyalagan 2019) ja HF (Berulava 2020). Vaikka joukko todisteita osoittaa, että epitranskriptomiikka vaikuttaa sydämen terveyteen ja sairauksiin, kaikki alkuperäiset tutkimukset ovat keskittyneet sydänlihakseen.

Perustelut, tavoitteet ja merkitys

Oletamme, että IHD:n patofysiologia heijastuu kiertävän RNA:n epitranskriptomiin. Esimerkiksi ribosomaalisella RNA:lla on pitkä puoliintumisaika ja sen muutokset sepelvaltimoverenkierrossa voivat reagoida sydämen tilaan.

IHD-ERPITRAN-projektin tavoitteet ovat: (1) luoda seulontaprotokollat ​​epitranskriptomisille biomarkkereille, (2) tarjota epitranskriptinen näkemys IHD:n patofysiologiasta, (3) tunnistaa joukko IHD-biomarkkeriehdokkaita ja (4) avata mahdollisuuksia terapeuttiseen käyttöön. kehitystä, jotka aiemmin jätettiin huomiotta tutkimuksen puutteen ja metodologisten rajoitusten vuoksi. Esimerkiksi tutkimusryhmämme on raportoinut pienmolekyylisten ligandien löydöstä RNA-metyylitransferaaseille (Selberg 2019).

Koska epitranskriptomialla on ehdotettu säätelevää roolia sydämessä ja IHD-EPITRAN on ensimmäisten joukossa, joka arvioi epitranskriptomisia veren biomarkkereita IHD:ssä, projekti sisältää avaimet tieteelliseen läpimurtoon, jolla on odotettavissa olevia maailmanlaajuisia kliinisiä etuja.

menetelmät

Tutkimuskohortit - 200 potilasta rekrytoidaan neljään kohorttiin, joista kussakin on 50 potilasta. Ensimmäinen kohortti koostuu potilaista, jotka saapuvat sydänyksikköön, joilla on akuutti MI revaskularisoitu perkutaanisella sepelvaltimointerventiolla (PCI). Kohortti antaa arvokasta tietoa tavasta, jolla akuutti IHD-fenotyyppi heijastuu veren epitranskripteihin. Toiseksi, hankkeen päätutkimuskohortti muodostetaan potilaista, joilla on stabiili IHD-fenotyyppi ja joita hoidetaan sepelvaltimoiden ohitusleikkauksella (CABG), ja se tarjoaa kriittistä tietoa kroonisesta iskemiasta ja sepelvaltimon aterogeneesistä, jotka molemmat ovat käynnissä hiljaisessa eli diagnosoimattomassa prosesseissa. IHD. Kolmanneksi potilaat, joille on määrä saada aorttaläpän korvaushoito (AVR) stenoosin ilman IHD:tä vuoksi, antavat positiiviselle kontrolliryhmälle erilaisen sydänpatologian, ja neljänneksi yhdessä terveiden ei-IHD-potilaiden kanssa, jotka on varmistettu sepelvaltimon tietokonetomografialla (CT). ), muodostavat projektin kontrollikohortit.

Tutkimusnäytteet - IHD-EPITRAN paljastaa verisoluja ja soluttomia RNA-epitranskriptejä kahdesti kerätyistä TEMPUS™- ja ​​EDTA-verinäytteistä, vastaavasti. Lisäksi MI- ja CABG-kohorteissa oikean eteisen lisäosan kudosnäytteistä saadut epitranskriptit puretaan vertailupisteeksi. Lopuksi mitataan joukko täydentäviä HF- ja IHD-biomarkkereita: NT-proBNP, hsCRP, sST2 ja TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 ja Tibaut 2019).

RNA-menetelmät - RNA:n eristämistä ja fraktiointia laboratoriossa validoiduilla menetelmillä seuraa seitsemän emäsmuunnoksen kvantitatiivinen analyysi käyttämällä UHPLC-kolmiolan kvadrupolinestekromatografia-tandem-massaspektrometria (LC-MS/MS) -järjestelmää (Selberg 2019). Kvantitatiivisen analyysin jälkeen suoritetaan anti-m6A-vasta-ainepohjainen RNA-esivalinta, jossa on runsaasti m6A-merkkejä sekvensoinnin kanssa, eli meRIP-seq. Loppujen lopuksi UHPLC-LC-MS/MS:n ja meRIP-seq:n jälkeen suora nanohuokosekvensointi, joka mahdollistaa m6A-merkkien tunnistamisen niiden natiivisekvensseissä, suoritetaan käyttämällä Liu et al.:n uutta ja äskettäin kehittämää algoritmia. (2019). Algoritmi perustuu tiettyjen proteiinin nanohuokosten läpi virtaavan m6A:n aiheuttamien sähkövirran tyypillisten häiriöiden tunnistamiseen.

DNA-sekvensointi – A-to-I RNA:n muokkaustapahtumien tunnistamiseksi koko genomin seuraavan sukupolven sekvensointi suoritetaan kaikille tutkimukseen osallistujille, jotta DNA:n ja RNA:n emäsvertailu voidaan vertailla (Park et al., 2012).

Bioinformatiikka - Sekvensoinnista saatujen massiivisten aineistojen tulkitsemiseksi bioinformatiikkaprotokollia kehitetään yhteistyössä Folkhälsanin (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) ja Lähi-idän teknisen yliopiston (professori Nurcan Tuncbag) bioinformatiikkatiimien kanssa. Sekvenssejä arvioidaan tunnettuja transkriptikirjastoja vastaan.

Kliiniset menetelmät - Kaikukuvaus antaa käsityksen sydämen toiminnallisesta tilasta, ja se suoritetaan ennalta määritetyillä parametreilla sekä ensimmäisen sairaalahoidon aikana että 3 kuukautta joko PCI:n, CABG:n tai AVR:n jälkeen. Näihin kardiologien vastaanottoihin sisältyy angina pectoriksen ja rasitushengityksen vakavuuden arviointi CCS- ja NYHA-luokituksen kanssa. Lisäksi mukana on sairastuvuuden itsearviointi standardoidulla Short Form 36 Health Survey -tutkimuksella. Lisäksi kerätään 6 kuukautta ennen leikkausta ja sen jälkeen potilastietojärjestelmähaku, joka sisältää sairaalahoidon, kuolemantapaukset ja sydän- ja verisuoniterveyteen liittyvät lääkityksen muutokset.

Tehoanalyysi - Kohorttikoot määritettiin RNAseqPS-verkkotyökalulla, joka on suunniteltu arvioimaan tilastollista tehoa RNAseq-kokeille (Guo et al., 2014). Käytetyt parametriarvot (väärien havaitsemisprosentti [FDR] <0,05, geenien kokonaismäärä testausta varten 20 000, ennustettuja prognostisia geenejä 1500, vähimmäiskertamuutoskynnys 2 differentiaalisen ilmentymisen osalta ja keskimääräiset lukumäärät 10 prognostisille geeneille) johdettiin soveltuvista raportti epitranskriptomiasta HF:n aikana (Berulava et al., 2020). Prognostista geenidispersioarvoa 0,215 sovellettiin Yoon & Nam 2017:n aiheeseen keskittyneen artikkelin perusteella, jossa analysoitiin dispersioita kymmenestä julkisesti saatavilla olevasta RNA-seq-tietojoukosta, joista neljä heijasti IHD-EPITRANiin soveltuvia toisiinsa liittymättömiä replikaatioita, joiden dispersiot vaihtelivat. 0,15 ja 0,28 välillä.

Yllä kuvatun tehoanalyysin perusteella n=25 kohorttia kohden antaa riittävän tehon (P≥0,95). Kohortit kaksinkertaistettiin mahdollisten esianalyyttisten virheiden korjaamiseksi sujuvasti, myöhempien validointi- ja seuranta-analyysien suorittamiseksi.

Potilasrekisterit

IHD-EPITRANin aikana kerätyt yksittäisten osallistujien tunnistetiedot tallennetaan pääosin sähköisessä muodossa HUS:n ja Taysin verkkokiintolevyille, jotka on suojattu rooliperusteisilla käyttöoikeuksilla. IHD-EPITRAN:ia varten luodaan kaksi erillistä rekisteriä: (1) Avainrekisteri, joka sisältää kaikki osallistujan tunnistetiedot ja linkit pseudonyymikoodien välillä, joita käytetään (2) tutkimusrekisterissä (täysin pseudonyymisissä), joka sisältää kaikki muut kerätyt tutkimustiedot. osallistujilta. Avainrekisterin liittymisoikeudet on IHD-EPITRANin johtaja Antti Vento. Rekisteriä säilytetään 10 vuotta mahdollisten myöhempien jatkoprojektien mahdollistamiseksi.

IHD-EPITRANiin on luotu molempien rekisterien käsittelykuvausasiakirjat sekä itsearviointiasiakirja tutkimuksen riskeistä. Nämä asiakirjat on tarkastellut ja hyväksynyt Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiirin eettinen lautakunta (Dnr. HUS/1211/2020).

Tutkimusryhmä

Dosentti Antti Vento on sekä IHD-EPITRAN -projektin että HUS:n sydän- ja keuhkokeskuksen johtaja. Kliinikoista, perustutkijoista ja analyyttisista asiantuntijoista koostuva poikkitieteellinen tiimi mahdollistaa IHD-EPITRAN:in synergistisen rekrytoinnin, näytteenoton ja valmistelun, joita seuraa IHD:ssa kiertävän RNA:n epitranskriptomisen maiseman bioinformaattiset analyysit. Dosentit Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala ja Satu Suihko, kaikki HUS:n sydänaseman kardiologit, suorittavat TT-potilaiden rekrytoinnin, kuvantamisanalyysit, MI-potilaiden hoidon sekä kolmanneksi MI-, CABG- ja AVR-potilaiden kontrollikäynnit. . Sydän- ja verisuonikirurgi Kari Teittinen HUS:n Sydän- ja keuhkokeskuksesta yhdessä sydän- ja rintakehäkirurgi Jahangir Khan PhD ja professori Jari Laurikan kanssa, molemmat Taysin sydänsairaalasta, suorittavat CABG- ja AVR-potilaiden rekrytointia ja leikkauksia. Tutkimussairaanhoitajat Kati Oksaharju HUS:n Sydän- ja keuhkokeskuksesta ja Tays Sydänsairaalasta koordinoivat potilasrekrytointia ja tiiviissä yhteistyössä laborantti Lahja Eurajoen kanssa näytteenottoa, kuljetusta ja pakastamisen jälkeistä nopeaa säilytystä. Projekti toteutetaan dosentti Esko Kankurin ja professori Eero Mervaalan (Helsingin yliopisto, CardioReg Group, Farmakologian laitos) laboratoriossa. B.M. Vilbert Sikorski ja MSc Daria Blokhina suorittavat yhteistyössä RNA-eristyksen, fraktioinnin, UHPLC-LC-MS/MS-analyysin ja protokollaartikkelien formuloinnin. Lisäksi Sikorski on yhteistyössä suunnitellut tutkimusprotokollaa muiden IHD-EPITRAN-yhteistyötekijöiden kanssa, hakenut tutkimuslupia ja jatkaa tiedonvaihdon koordinointia yhteistyökumppaneiden välillä ja toteuttaa tulosartikkelien kirjoittamista yhteistyökumppaneiden kanssa.

Etiikka

Tämä tutkimus suoritetaan HUS:n eettisen lautakunnan hyväksymän protokollan mukaisesti (Dnr. HUS/1211/2020). Asianomaiset alueelliset ja kansalliset lautakunnat arvioivat pöytäkirjan myöhemmin monikeskusnäytteen keräämistä varten. Huolehditaan siitä, että jokaisella tutkimukseen osallistuneella on riittävästi aikaa perehtyä tutkimuspöytäkirjaan. Sen jälkeen käydään tietoinen suostumuskeskustelu ja osallistujalta hankitaan kirjallinen tietoinen suostumus.