冠動脈疾患のエピトランスクリプトーム血液バイオマーカー - 前向きコホート研究 (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

背景 - 虚血性心疾患

世界で 1 億 2,650 万人が罹患し、年間 890 万人が死亡する虚血性心疾患 (IHD) は、主要な死因です (GBD Collaborators 2017)。 IHD は、進行中のアテローム発生の結果として発生します。これは、冠状動脈の壁に脂質が蓄積するプロセスです。 最終的に、コレステロールおよびカルシウムの蓄積は、血管内腔を狭める沈着物、すなわちプラークを形成します。 心筋梗塞（MI）の発症時に、そのようなプラークが破裂し、血管の血液供給に依存する心筋の無酸素死につながります。 短期的には、心臓の機能は硬い傷跡の形成によって救われます. 時間が経つにつれて、ポンプ機能は通常、その後の心不全 (HF) で悪化します。

最適には、血液から疾患バイオマーカーを分析し、疾患の進行、重症度に関する洞察を提供し、治療効果の評価を支援します。 残念ながら、IHD に最適なバイオマーカーはこれまで特定されていません。 未診断の IHD を患っており、早期診断の恩恵を受けている膨大な数の無数の患者は、IHD バイオマーカーの必要性を強調しています。

背景 - エピトランスクリプトミクス

DNA エピジェネティクスに類似した、RNA の転写後修飾の分野であるエピトランスクリプトミクスは、最近、より科学的な注目を集めています (Saletore 2012)。 この拡大する分野は、細胞増殖から死に至るプロセスを制御する生物学的調節の新しい層を明らかにしています。

RNA 種では 170 以上の RNA 修飾が確認されていますが (Yang 2018)、窒素 6 位置 (m6A) でのアデノシンのメチル化は、最も一般的で集中的に研究されているものの 1 つとして際立っています (Liu 2020)。 1970 年代の m6A メチル化 mRNA の最初の発見 (Desrosiers 1974) に続いて、エピトランスクリプトミクスは、m6A を評価するための信頼できる in vivo 方法の開発によって、過去 10 年間に再燃しただけです (Dominissini 2012)。 これらの初期の免疫沈降ベースの方法論 (すなわち meRIP-seq) は、特定の m6A 句読点パターンと具体的に示されたライター (メチルトランスフェラーゼ; METTL3/14/WTAP1 複合体および METTL16)、リーダー (結合タンパク質; YTH-タンパク質ファミリー)、および消しゴム (デメチラーゼ; ALKBH5; Zaccara 2019)。

YTHドメインファミリーからのm6A効果を仲介する複数のリーダーが特定されています。 YTHDF1-3 は、それぞれ mRNA の翻訳、分解、またはその両方を促進します。 YTHDC1-2、eIF2、METTL3、およびリボソームも m6A を認識し、翻訳と細胞質区画化を促進します (Zaccara 2019)。

m6A レベルの変化は、がん、心血管疾患、神経疾患など、数多くの病状に関連しています (Frye 2016)。 m6Aライターとイレーザーのノックアウトと過剰発現の両方を使用した研究により、免疫反応、細胞増殖、移動、アポトーシスの促進におけるそれらの役割が明らかになりました (Delaunay 2019)。

背景 - エピトランスクリプトミクスと心臓

最近発表された一連の研究は、高血圧 (Jain 2018)、血管新生 (Kwast 2019) における m6A および A-to-I 編集 (アデノシンからイノシン、塩基対を変更することによってトランスクリプトームを多様化する別の一般的な修飾) の両方の役割を示唆しています。 、心筋肥大 (Dorn 2019、Kmietchyk 2019)、虚血 (Mathiyalagan 2019)、心不全 (Berulava 2020)。 一連の証拠はエピトランスクリプトミクスが心臓の健康と病気に寄与していることを示していますが、初期の研究はすべて心筋に焦点を当てていました。

根拠、目的および意義

IHD の病態生理は、循環 RNA のエピトランスクリプトームに反映されているという仮説を立てています。 たとえば、リボソーム RNA は半減期が長く、冠循環におけるその修飾は心臓の状態に反応する可能性があります。

IHD-ERPITRAN プロジェクトの目的は、(1) エピトランスクリプトーム バイオマーカーのスクリーニング プロトコルを確立すること、(2) IHD の病態生理に対するエピトランスクリプトームの洞察を提供すること、(3) IHD バイオマーカー候補のセットを特定すること、および (4) 治療への道を開くことです。研究の欠如と方法論的限界のために以前は無視されていた開発。 たとえば、私たちの研究グループは、RNA メチルトランスフェラーゼの低分子リガンドの発見を報告しました (Selberg 2019)。

エピトランスクリプトミクスは心臓で調節的役割を果たすことが示唆されており、IHD-EPITRAN は IHD でエピトランスクリプトーム血液バイオマーカーを評価した最初の 1 つであるため、このプロジェクトは、期待される世界的な臨床的利益を伴う科学的ブレークスルーの鍵を握っています。

メソッド

研究コホート - 200 人の患者を 4 つのコホートに募集し、それぞれ 50 人の患者を数えます。 最初のコホートは、経皮的冠動脈インターベンション (PCI) で血行再建された急性心筋梗塞でハートユニットに来院した患者で構成され、急性 IHD 表現型が血液エピトランスクリプトームに反映される方法に貴重な洞察を与えるコホートです。 第二に、プロジェクトの主な研究コホートは、冠動脈バイパス移植術 (CABG) で治療された安定した IHD 表現型の患者から形成され、慢性虚血および冠動脈アテローム発生に関する重要な情報を提供します。 IHD。 第 3 に、IHD のない狭窄による大動脈弁置換術 (AVR) 療法を受ける予定の患者は、陽性対照群に異なる心臓病理学を提供し、第 4 に、冠動脈コンピューター断層撮影 (CT) で検証された健康な非 IHD 患者と共に)、プロジェクトのコントロール コホートを形成します。

研究サンプル - IHD-EPITRAN は、2 回収集された TEMPUS(TM) および EDTA 血液サンプルから、それぞれ血中細胞および無細胞 RNA エピトランスクリプトームを明らかにします。 さらに、MI および CABG コホートの場合、右心耳組織サンプルからのエピトランスクリプトームが参照点として解読されます。 最後に、補助的な HF および IHD バイオマーカーのセット: NT-proBNP、hsCRP、sST2、および TMAO (Aimo 2019、Ahmadmehrabi 2017、および Tibaut 2019) が測定されます。

RNA 法 - ラボで検証された方法による RNA の分離と分画に続いて、UHPLC-トリプル四重極液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC-MS/MS) システムを利用した 7 つの塩基修飾の定量分析が行われます (Selberg 2019)。 定量分析に続いて、m6A マークが豊富な抗 m6A 抗体ベースの RNA 事前選択が、シーケンスと並行して行われます。つまり、meRIP-seq が実行されます。 最終的に、UHPLC-LC-MS/MS および meRIP-seq の後、ネイティブ シーケンス内の m6A マークの識別を可能にする直接ナノポア ロングリード シーケンスが、Liu らによって最近開発された新しいアルゴリズムを使用して実行されます。 （2019）。 このアルゴリズムは、特定のタンパク質ナノポアを流れる m6A による電流の特徴的な中断の認識に基づいています。

DNA 配列決定 - A-to-I RNA 編集イベントを特定するために、すべての研究参加者に対して全ゲノム次世代配列決定が実行され、一致する DNA-to-RNA 塩基比較が可能になります (Park et al., 2012)。

バイオインフォマティクス - シーケンスから得られた大量のデータセットを解釈するために、バイオインフォマティクス プロトコルは、Folkhälsan (Karolinska Institutet、Katayma Shintaro 博士) および中東工科大学 (Nurcan Tuncbag 教授) のバイオインフォマティクス チームと協力して開発されています。 シーケンスは、既知のトランスクリプト ライブラリに対して評価されます。

臨床的方法 - 心エコー検査は、心臓の機能状態に関する洞察を提供し、最初の入院中と、PCI、CABG、または AVR のいずれかの 3 か月後の両方で、事前に指定されたパラメータで実行されます。 これらの心臓専門医の任命には、狭心症および労作性呼吸困難の重症度評価と、それぞれ CCS および NYHA の等級付けが含まれます。 さらに、標準化されたShort Form 36 Health Surveyによる罹患率の自己評価が含まれています。 さらに、心臓血管の健康に関連する入院、死亡、投薬変更を含む患者記録システム検索が、手術の前後 6 か月間で収集されます。

検出力分析 - コホートのサイズは、RNAseq 実験の統計的検出力を評価するために設計された RNAseqPS Web ツールを使用して決定されました (Guo et al., 2014)。 使用されたパラメーター値 (偽発見率 [FDR] <0.05、テスト用遺伝子総数 20,000、予測予後遺伝子 1500、差次的発現の最小倍数変化しきい値 2、予後遺伝子の平均読み取りカウント 10) は、該当するものから導出されました。心不全中のエピトランスクリプトミクスに関する報告 (Berulava et al., 2020)。 Yoon & Nam 2017 の問題に焦点を当てた記事に基づいて、0,215 の予後遺伝子分散値が適用されました。 0.15 から 0.28 の間。

上記の検出力分析に基づくと、コホートあたり n=25 で十分な検出力が得られます (P≥0.95)。 可能性のある分析前のエラーに流暢に取り組み、その後の検証とフォローアップ分析を実行するために、コホートは 2 倍になりました。

患者登録

IHD-EPITRAN 中に収集された個々の参加者の識別情報データは、主に役割ベースのアクセス権によって保護されている HUS と Tays のネットワーク ハード ドライブに電子形式で保存されます。 IHD-EPITRAN 用に 2 つの別個のレジストリが作成されます。(1) すべての参加者識別情報と、(2) 収集された他のすべての研究情報を含む研究レジストリ (完全に仮名化) で使用される仮名化コード間のリンクを含むキー レジストリ。参加者から。 IHD-EPITRAN のディレクターである Antti Vento は、キー レジストリへの加入権を持っています。 レジストリは 10 年間保存され、その後のフォローアップ プロジェクトを可能にします。

研究のリスクに関する自己評価文書とともに、両方のレジストリの処理説明文書が、フィンランド語で IHD-EPITRAN 用に作成されました。 これらの文書は、ヘルシンキおよびウーシマーの病院地区の倫理委員会 (Dnr. HUS/1211/2020)。

研究グループ

Docent Antti Vento は、IHD-EPITRAN プロジェクトと HUS Heart and Lung Center のディレクターです。 臨床医、基礎研究者、分析専門家で構成される学際的なチームにより、IHD-EPITRAN はリクルート、サンプル収集、準備を相乗的に実行し、続いて IHD 内の循環 RNA のエピトランスクリプトーム ランドスケープのバイオインフォマティクス分析を行うことができます。 医師の Mika Laine、Pasi Karjalainen、Helena Rajala、Satu Suihko はすべて HUS ハート ステーションの心臓専門医で、CT 患者のリクルート、画像解析、MI 患者の治療、そして MI、CABG、AVR 患者の管理予約を行います。 . HUS Heart and Lung Center の心臓および血管外科医の Kari Teittinen は、Tays Heart Hospital の心臓胸部外科医 Jahangir Khan PhD および教授 Jari Laurikka と共に、CABG および AVR 患者の募集とその手術を行っています。 それぞれ HUS Heart and Lung Center と Tays Heart Hospital の研究看護師である Kati Oksaharju と Kati Helleharju は、患者の募集を調整し、ラボラトリーの Lahja Eurajoki と緊密に協力して、サンプルの収集、輸送、凍結後の迅速な保管を行っています。 このプロジェクトは、講師の Esko Kankuri と Eero Mervaala 教授 (ヘルシンキ大学、CardioReg Group、薬理学科) の研究室で実施されます。 BM Vilbert Sikorski と MSc Daria Blokhina は、共同で RNA の分離、分画、UHPLC-LC-MS/MS 分析、およびプロトコル記事の作成を行います。 さらに、Sikorski は、他の IHD-EPITRAN 共著者と協力して研究プロトコルを計画し、研究許可を適用し、共同研究者間の情報交換を調整し続け、共著者との結果記事の執筆を行っています。

倫理

この研究は、HUS 倫理委員会 (Dnr. HUS/1211/2020)。 それぞれの地域および国の委員会は、その後、多施設サンプル収集のプロトコルを評価します。 各研究参加者が研究プロトコルに慣れるのに十分な時間を確保できるように注意が払われます。 その後、インフォームド コンセント ディスカッションが開催され、参加者から書面によるインフォームド コンセントが得られます。