Epitranscriptomic Blood Biomarkers for Coronary Artery Disease - En prospektiv kohortstudie (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Bakgrund - ischemisk hjärtsjukdom

Med en global prevalens på 126,5 miljoner människor och en årlig dödlighet på 8,9 miljoner är ischemisk hjärtsjukdom (IHD) den vanligaste dödsorsaken (GBD Collaborators 2017). IHD utvecklas som ett resultat av en pågående aterogenes, en process av lipiduppbyggnad i kransartärernas väggar. Så småningom bildar ansamlingen av kolesterol och kalcium avlagringar, d.v.s. plack, som minskar kärlets lumina. Vid uppkomsten av hjärtinfarkt (MI) brister en sådan plack, vilket leder till anoxisk död av myokardiet beroende på blodtillförseln av kärlet. På kort sikt räddas hjärtats funktion genom att det bildas ett stelt ärr. Med tiden försämras vanligtvis pumpfunktionen med påföljande hjärtsvikt (HF).

Optimalt analyseras sjukdomsbiomarkörer från blod och ger både insikt i sjukdomsprogression, svårighetsgrad och hjälper till att utvärdera terapins effekt. Tyvärr har optimala biomarkörer för IHD inte identifierats hittills. Det stora men oräkneliga antalet personer som lever med odiagnostiserad IHD, som drar nytta av en tidig diagnos, understryker behovet av en IHD-biomarkör.

Bakgrund - Epitranscriptomics

Epitranscriptomics, området för posttranskriptionella modifieringar av RNA, analogt med DNA-epigenetik, har nyligen fått mer vetenskaplig anmärkning (Saletore 2012). Detta expanderande fält avslöjar ett nytt lager av biologisk reglering som kontrollerar processer som sträcker sig från cellproliferation till död.

Även om mer än 170 RNA-modifieringar har identifierats i RNA-arter (Yang 2018), framstår adenosinmetylering i kväve-6-positionen (m6A) som en av de vanligaste och mest intensivt studerade (Liu 2020). Efter de första fynden av m6A-metylerade mRNA på 1970-talet (Desrosiers 1974) har epitranskriptomik bara återuppstått under det senaste decenniet med utvecklingen av tillförlitliga in vivo-metoder för att bedöma m6A (Dominissini 2012). Dessa tidiga immunoutfällningsbaserade metoder (dvs. meRIP-seq) underlättade upptäckterna av de specifika m6A-interpunktionsmönstren och de specifikt angivna skribenterna (metyltransferaser; METTL3/14/WTAP1-komplex och METTL16), läsare (bindande proteiner; t.ex. YTH-proteinfamiljen) och radergummi (demetylaser; ALKBH5; Zaccara 2019).

Flera läsare som förmedlar m6A-effekterna från YTH-domänfamiljen har identifierats. YTHDF1-3 främjar mRNA-translation, nedbrytning eller båda. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 och ribosomer känner också igen m6A och främjar translation och cytoplasmatisk kompartmentalisering (Zaccara 2019).

Förändringar i m6A-nivåer har associerats med många patologier, inklusive cancer, kardiovaskulära och neurologiska störningar (Frye 2016). Studier som använder både knockout och överuttryck av m6A-skrivare och suddgummi har avslöjat deras roll i att driva immunreaktivitet, cellproliferation, migration och apoptos (Delaunay 2019).

Bakgrund - Epitranskriptomik & hjärta

En nyligen publicerad uppsättning studier tyder på en roll för både m6A- och A-till-I-redigering (adenosin-till-inosin, en annan vanlig modifiering som diversifierar transkriptomet genom att ändra basparning) under hypertoni (Jain 2018), neovaskularisering (Kwast 2019) , myokardhypertrofi (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), ischemi (Mathiyalagan 2019) och HF (Berulava 2020). Medan en mängd bevis indikerar epitranskriptomik som en bidragande orsak till hjärthälsa och sjukdomar, har alla de första studierna fokuserat på hjärtmuskeln.

Bakgrund, mål och betydelse

Vi antar att patofysiologin för IHD återspeglas i epitranskriptomet av det cirkulerande RNA:t. Till exempel har ribosomalt RNA en lång halveringstid och dess modifieringar i kranskärlscirkulationen kan svara på hjärtats tillstånd.

Målen för IHD-ERPITRAN-projektet är: (1) att upprätta screeningprotokoll för epitranskriptomiska biomarkörer, (2) ge epitranskriptomisk insikt i IHD-patofysiologin, (3) identifiera en uppsättning IHD-biomarkörkandidater och (4) öppna vägar för terapeutisk utveckling som tidigare ignorerats på grund av bristande forskning och metodologiska begränsningar. Till exempel har vår forskargrupp rapporterat en upptäckt av småmolekylära ligander för RNA-metyltransferaser (Selberg 2019).

Eftersom epitranskriptomik har föreslagits spela en reglerande roll i hjärtat och IHD-EPITRAN är bland de första att utvärdera epitranskriptomiska blodbiomarkörer i IHD, har projektet nycklar för ett vetenskapligt genombrott med förväntade globala kliniska fördelar.

Metoder

Studiekohorter - 200 patienter rekryteras till fyra kohorter som räknar 50 patienter vardera. Den första kohorten består av patienter som presenterar sig för hjärtenheten med ett akut hjärtinfarkt revaskulariserat med perkutan kranskärlsintervention (PCI), en kohort som ger värdefull insikt i hur den akuta IHD-fenotypen speglas i blodets epitranskriptom. För det andra kommer huvudstudiekohorten i projektet att bildas av patienter med stabil IHD-fenotyp som behandlats med kranskärlsbypasstransplantation (CABG) och erbjuder kritisk information med avseende på kronisk ischemi och koronar aterogenes, båda pågående processer i det tysta, d.v.s. odiagnostiserade, IHD. För det tredje ger patienter som är avsedda för en aortaklaffsersättningsterapi (AVR) på grund av stenos utan IHD den positiva kontrollgruppen en annan hjärtpatologi, och för det fjärde, tillsammans med de friska icke-IHD-patienter som verifierats med koronar datortomografi (CT). ), utgör projektets kontrollkohorter.

Studieprover - IHD-EPITRAN avslöjar blodcellulära och cellfria RNA-epitranskriptomer från de två gånger insamlade TEMPUS(TM)- respektive EDTA-blodproverna. Dessutom, för MI- och CABG-kohorter, dechiffreras epitranskriptomerna från vävnadsprover för höger förmaksbihang för en referenspunkt. Slutligen mäts en uppsättning kompletterande HF- och IHD-biomarkörer: NT-proBNP, hsCRP, sST2 och TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 och Tibaut 2019).

RNA-metoder - RNA-isolering och fraktionering med laboratorievaliderade metoder följs av den kvantitativa analysen av sju basmodifieringar med ett UHPLC-trippelkvadrupol vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) system (Selberg 2019). Efter den kvantitativa analysen utförs anti-m6A-antikroppsbaserad RNA-förval rik på m6A-märken i tandem med sekvensering, dvs meRIP-seq. I slutändan, efter UHPLC-LC-MS/MS och meRIP-seq, utförs direkt nanopore långläst sekvensering som möjliggör identifiering av m6A-märkena i deras ursprungliga sekvenser med den nya och nyligen utvecklade algoritmen av Liu et al. (2019). Algoritmen baseras på erkännandet av de karakteristiska störningarna av elektrisk ström av m6A som flödar genom specifika proteinnanoporer.

DNA-sekvensering - För att identifiera A-till-I RNA-redigeringshändelserna utförs en nästa generations sekvensering av hela genomet för alla studiedeltagare för att möjliggöra en matchad DNA-till-RNA-basjämförelse (Park et al., 2012).

Bioinformatik - För att tolka de massiva datamängderna från sekvenseringen utvecklas bioinformatikprotokoll i samarbete med bioinformatikteamen från Folkhälsan (Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) och Middle East Technical University (professor Nurcan Tuncbag). Sekvenserna utvärderas mot kända transkriptbibliotek.

Kliniska metoder - Ekokardiografin ger insikt i hjärtats funktionstillstånd och utförs med fördefinierade parametrar både under den initiala sjukhusvistelsen och 3 månader efter antingen PCI, CABG eller AVR. Dessa kardiologers besök inkluderar svårighetsbedömningen av angina pectoris och ansträngningsdyspné med CCS- respektive NYHA-graderingar. Dessutom ingår självutvärdering av sjuklighet med den standardiserade Short Form 36 Health Survey. Dessutom samlas en sökning i patientjournalsystem, inklusive sjukhusinläggningar, dödsfall och läkemedelsförändringar associerade med kardiovaskulär hälsa, in 6 månader före och efter operationen.

Effektanalys - Kohortstorlekarna bestämdes med RNAseqPS webbverktyg designat för att utvärdera statistisk kraft för RNAseq-experiment (Guo et al., 2014). Parametervärden som användes (false discovery rate [FDR] <0,05, totalt antal gener för att testa 20 000, förutspådda prognosgener 1500, minsta fold change tröskel 2 för differentiellt uttryck och genomsnittliga avläsningsantal på 10 för prognostiska gener) härleddes från en tillämplig rapport om epitranskriptomik under HF (Berulava et al., 2020). Prognostisk genspridningsvärde på 0,215 tillämpades baserat på artikeln med fokus på frågan av Yoon & Nam 2017, som analyserade dispersioner från tio allmänt tillgängliga RNA-seq-datauppsättningar, varav fyra återspeglade orelaterade replikat som är tillämpliga för IHD-EPITRAN med spridningarna som sträcker sig mellan 0,15 och 0,28.

Baserat på effektanalysen som beskrivs ovan ger n=25 per kohort tillräcklig effekt (P≥0,95). För att flytande ta itu med eventuella preanalytiska fel, utföra efterföljande validerings- och uppföljningsanalyser, fördubblades kohorterna.

Patientregister

Individuell identifieringsinformation för deltagare som samlas in under IHD-EPITRAN kommer huvudsakligen att lagras i elektrisk form på HUS:s och Tays nätverkshårddiskar som skyddas av rollbaserade åtkomsträttigheter. Två separata register skapas för IHD-EPITRAN: (1) Ett nyckelregister, som innehåller all deltagares identifieringsinformation och länkar mellan pseudonymiseringskoder som används i (2) forskningsregistret (helt pseudonymiserat) som innehåller all annan insamlad studieinformation från deltagarna. Antti Vento, direktören för IHD-EPITRAN, har anslutningsrättigheterna till nyckelregistret. Registren lagras i 10 år för att möjliggöra senare uppföljningsprojekt.

Bearbetningsbeskrivningsdokument för båda registren, tillsammans med självbedömningsdokument för riskerna med studien, har skapats för IHD-EPITRAN på finska. Dessa dokument har granskats och godkänts av Etiknämnden vid Helsingfors och Nylands sjukvårdsdistrikt (Dnr. HUS/1211/2020).

Forskningsgrupp

Docent Antti Vento är chef för både IHD-EPITRAN-projektet och HUS Heart and Lung Center. Det tvärvetenskapliga teamet bestående av kliniker, grundforskare och analytiska experter gör det möjligt för IHD-EPITRAN att synergistiskt utföra rekrytering, provinsamling och förberedelse följt av bioinformatiska analyser av det epitranskriptomiska landskapet av cirkulerande RNA i IHD. Docenterna Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala och Satu Suihko, alla kardiologer från HNS hjärtstation, kommer att utföra CT-patienternas rekrytering, bildanalyser, behandling av MI-patienterna och för det tredje MI-, CABG- och AVR-patienternas kontrollbesök . Hjärt- och kärlkirurgen Kari Teittinen från HNS hjärt- och lungcentrum genomför tillsammans med hjärt- och thoraxkirurgen Jahangir Khan PhD och professor Jari Laurikka, båda från Tays Heart Hospital, rekryteringen av CABG- och AVR-patienterna och deras operationer. Forskningssjuksköterskorna Kati Oksaharju och Kati Helleharju, från HNS hjärt- och lungcentrum respektive Tays hjärtsjukhus, samordnar patientrekryteringen och i nära samarbete med laboranten Lahja Eurajoki provtagning, transport och snabbförvaring efter frysning. Projektet kommer att genomföras i laboratoriet för docent Esko Kankuri och professor Eero Mervaala (Helsingfors universitet, CardioReg Group, Farmakologiska institutionen). B.M. Vilbert Sikorski och MSc Daria Blokhina kommer att tillsammans utföra RNA-isolering, fraktionering, UHPLC-LC-MS/MS-analys och protokollartikelformulering. Dessutom har Sikorski i samarbete planerat studieprotokoll med de andra IHD-EPITRAN-medförfattarna, ansökt om studietillstånd och fortsätter att koordinera informationsutbyte mellan samarbetspartners och skriver resultatartikel med medförfattarna.

Etik

Denna studie kommer att genomföras i enlighet med det protokoll som godkänts av HUS etiknämnd (Dnr. HUS/1211/2020). Respektive regionala och nationella styrelser kommer att utvärdera protokollet i efterhand för multicenterprovinsamlingen. Försiktighet kommer att iakttas så att varje studiedeltagare har tillräckligt med tid att bekanta sig med studieprotokollet. Därefter kommer en diskussion om informerat samtycke att hållas och skriftligt informerat samtycke erhålls från deltagaren.