Epitranskryptomiczne biomarkery krwi w chorobie wieńcowej — prospektywne badanie kohortowe (IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

Tło - choroba niedokrwienna serca

Przy globalnej chorobowości 126,5 miliona ludzi i rocznej śmiertelności 8,9 miliona, choroba niedokrwienna serca (ChNS) jest główną przyczyną śmierci (GBD Collaborators 2017). IHD rozwija się w wyniku trwającej aterogenezy, procesu gromadzenia się lipidów w ścianach tętnic wieńcowych. Ostatecznie nagromadzenie cholesterolu i wapnia tworzy złogi, czyli blaszki, które zwężają światło naczynia. Na początku zawału mięśnia sercowego (MI) taka blaszka miażdżycowa pęka, co prowadzi do beztlenowej śmierci mięśnia sercowego zależnej od ukrwienia naczynia. Na krótką metę czynność serca jest ratowana przez utworzenie sztywnej blizny. Z biegiem czasu czynność pompowania zwykle pogarsza się, co prowadzi do niewydolności serca (HF).

Optymalnie biomarkery choroby są analizowane z krwi i zapewniają zarówno wgląd w postęp choroby, nasilenie, jak i pomagają w ocenie skuteczności terapii. Niestety, do tej pory nie zidentyfikowano optymalnych biomarkerów dla IHD. Ogromna, ale niezliczona liczba osób żyjących z niezdiagnozowaną IHD, korzystających z wczesnej diagnozy, podkreśla potrzebę biomarkera IHD.

Tło - Epitranskryptomika

Epitranskryptomika, dziedzina potranskrypcyjnych modyfikacji RNA, analogiczna do epigenetyki DNA, zyskała ostatnio większe zainteresowanie naukowe (Saletore 2012). Ta rozwijająca się dziedzina odkrywa nową warstwę regulacji biologicznej, która kontroluje procesy od proliferacji komórek do śmierci.

Chociaż w gatunkach RNA zidentyfikowano ponad 170 modyfikacji RNA (Yang 2018), metylacja adenozyny w pozycji azotu-6 (m6A) wyróżnia się jako jedna z najczęściej spotykanych i intensywnie badanych (Liu 2020). Po początkowych odkryciach metylowanych mRNA m6A w latach 70. XX wieku (Desrosiers 1974), epitranskryptomika rozpaliła się ponownie dopiero w ostatniej dekadzie wraz z rozwojem wiarygodnych metod oceny m6A in vivo (Dominissini 2012). Te wczesne metodologie oparte na immunoprecypitacji (tj. meRIP-seq) ułatwiło odkrycie specyficznych wzorców interpunkcyjnych m6A i specyficznie określonych pisarzy (metylotransferazy; kompleks METTL3/14/WTAP1 i METTL16), czytelników (białka wiążące; np. rodzina białek YTH) i gumki (demetylazy; ALKBH5; Zaccara 2019).

Zidentyfikowano wielu czytelników pośredniczących w efektach m6A z rodziny domen YTH. YTHDF1-3 promuje odpowiednio translację mRNA, degradację lub oba. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 i rybosomy również rozpoznają m6A i promują translację i kompartmentalizację cytoplazmatyczną (Zaccara 2019).

Zmiany w poziomach m6A były związane z licznymi patologiami, w tym nowotworami, zaburzeniami sercowo-naczyniowymi i neurologicznymi (Frye 2016). Badania wykorzystujące zarówno nokaut, jak i nadekspresję pisarzy i gumek m6A ujawniły ich rolę w kierowaniu reaktywnością immunologiczną, proliferacją komórek, migracją i apoptozą (Delaunay 2019).

Tło - Epitranskryptomika i serce

Niedawno opublikowany zestaw badań sugeruje rolę zarówno edycji m6A, jak i A-do-I (adenozyna do inozyny, kolejna powszechna modyfikacja różnicująca transkryptom poprzez zmianę parowania zasad) podczas nadciśnienia (Jain 2018), neowaskularyzacji (Kwast 2019) , przerost mięśnia sercowego (Dorn 2019, Kmietczyk 2019), niedokrwienie (Mathiyalagan 2019) i HF (Berulava 2020). Podczas gdy zbiór dowodów wskazuje, że epitranskryptomika przyczynia się do zdrowia i chorób serca, wszystkie wstępne badania koncentrowały się na mięśniu sercowym.

Uzasadnienie, cele i znaczenie

Stawiamy hipotezę, że patofizjologia IHD znajduje odzwierciedlenie w epitranskryptomie krążącego RNA. Na przykład rybosomalny RNA ma długi okres półtrwania, a jego modyfikacje w krążeniu wieńcowym mogą reagować na stan serca.

Cele projektu IHD-ERPITRAN to: (1) ustanowienie protokołów badań przesiewowych dla biomarkerów epitranskryptomicznych, (2) zapewnienie wglądu epitranskryptomicznego w patofizjologię IHD, (3) zidentyfikowanie zestawu kandydujących biomarkerów IHD oraz (4) otwarcie dróg terapeutycznych rozwoju, które wcześniej były pomijane ze względu na brak badań i ograniczenia metodologiczne. Na przykład nasza grupa badawcza zgłosiła odkrycie małocząsteczkowych ligandów dla metylotransferaz RNA (Selberg 2019).

Ponieważ zasugerowano, że epitranskryptomika odgrywa rolę regulacyjną w sercu, a IHD-EPITRAN jako jeden z pierwszych ocenia biomarkery epitranskryptomiczne krwi w IHD, projekt ma klucz do przełomu naukowego, który przyniesie oczekiwane globalne korzyści kliniczne.

Metody

Kohorty badawcze — 200 pacjentów rekrutuje się do czterech kohort liczących po 50 pacjentów w każdej. Pierwsza kohorta składa się z pacjentów zgłaszających się do Heart Unit z powodu ostrego zawału mięśnia sercowego rewaskularyzowanego za pomocą przezskórnej interwencji wieńcowej (PCI), kohorty, która daje cenny wgląd w sposób, w jaki fenotyp ostrej IHD jest odzwierciedlany w epitranskryptomach krwi. Po drugie, główna kohorta badawcza projektu zostanie utworzona z pacjentów ze stabilnym fenotypem IHD leczonych pomostowaniem aortalno-wieńcowym (CABG) i dostarczy krytycznych informacji w odniesieniu do przewlekłego niedokrwienia i aterogenezy wieńcowej, obu zachodzących procesów w niemym, tj. niezdiagnozowanym, choroba niedokrwienna serca. Po trzecie, pacjenci kwalifikowani do leczenia wymiany zastawki aortalnej (AVR) z powodu zwężenia bez IHD stanowią pozytywną grupę kontrolną z odmienną patologią serca, a po czwarte, razem ze zdrowymi pacjentami bez IHD zweryfikowanymi za pomocą wieńcowej tomografii komputerowej (CT ), tworzą kohorty kontrolne projektu.

Badane próbki — IHD-EPITRAN wykrywa komórkowe i bezkomórkowe epitranskryptomy RNA z odpowiednio dwukrotnie pobranych próbek krwi TEMPUS™ i EDTA. Ponadto w przypadku kohort MI i CABG epitranskryptomy z próbek tkanki uszka prawego przedsionka są odszyfrowywane w celu uzyskania punktu odniesienia. Na koniec mierzy się zestaw uzupełniających biomarkerów HF i IHD: NT-proBNP, hsCRP, sST2 i TMAO (Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 i Tibaut 2019).

Metody RNA - Po izolacji i frakcjonowaniu RNA metodami zatwierdzonymi w laboratorium następuje analiza ilościowa modyfikacji siedmiu zasad z wykorzystaniem systemu UHPLC-potrójna kwadrupolowa chromatografia cieczowa-tandemowa spektrometria mas (LC-MS/MS) (Selberg 2019). Po analizie ilościowej przeprowadza się preselekcję RNA na bazie przeciwciała anty-m6A bogatego w znaczniki m6A w tandemie z sekwencjonowaniem, tj. meRIP-seq. Ostatecznie, po UHPLC-LC-MS/MS i meRIP-seq, przeprowadza się bezpośrednie sekwencjonowanie długiego odczytu nanoporów, umożliwiające identyfikację znaków m6A w ich natywnych sekwencjach, przy użyciu nowatorskiego i niedawno opracowanego algorytmu Liu i in. (2019). Algorytm opiera się na rozpoznawaniu charakterystycznych zakłóceń prądu elektrycznego m6A przepływającego przez określone nanopory białkowe.

Sekwencjonowanie DNA - W celu zidentyfikowania zdarzeń edycji RNA z A do I, przeprowadza się sekwencjonowanie całego genomu nowej generacji dla wszystkich uczestników badania, aby umożliwić porównanie dopasowanych zasad DNA do RNA (Park i in., 2012).

Bioinformatyka - W celu interpretacji ogromnych zbiorów danych uzyskanych z sekwencjonowania, protokoły bioinformatyczne są opracowywane we współpracy z zespołami bioinformatycznymi z Folkhälsan (Karolinska Institutet, dr Shintaro Katayma) i Middle East Technical University (profesor Nurcan Tuncbag). Sekwencje są oceniane względem znanych bibliotek transkryptów.

Metody kliniczne - Echokardiografia daje wgląd w stan czynnościowy serca i jest wykonywana z określonymi parametrami zarówno podczas pierwszej hospitalizacji, jak i 3 miesiące po PCI, CABG lub AVR. Wizyty tych kardiologów obejmują ocenę nasilenia dławicy piersiowej i duszności wysiłkowej odpowiednio w stopniach CCS i NYHA. Ponadto uwzględniono samoocenę zachorowalności za pomocą standardowego krótkiego formularza 36 ankiety zdrowotnej. Ponadto system przeszukiwania rekordów pacjentów, w tym przyjęć do szpitala, zgonów i zmian leków związanych ze zdrowiem układu krążenia, jest gromadzony 6 miesięcy przed operacją i po niej.

Analiza mocy — wielkości kohort określono za pomocą narzędzia internetowego RNAseqPS przeznaczonego do oceny mocy statystycznej eksperymentów RNAseq (Guo i in., 2014). Zastosowane wartości parametrów (współczynnik fałszywego wykrywania [FDR] <0,05, całkowita liczba genów do testowania 20 000, przewidywane geny prognostyczne 1500, próg minimalnej krotności zmiany 2 dla ekspresji różnicowej i średnia liczba odczytów wynosząca 10 dla genów prognostycznych) pochodziły z odpowiedniego doniesienie dotyczące epitranskryptomiki podczas HF (Berulava i in., 2020). Prognostyczna wartość dyspersji genów wynosząca 0,215 została zastosowana na podstawie artykułu skupiającego się na problemie autorstwa Yoon & Nam 2017, w którym przeanalizowano dyspersje z dziesięciu publicznie dostępnych zestawów danych RNA-seq, z których cztery odzwierciedlały niepowiązane repliki mające zastosowanie do IHD-EPITRAN z dyspersjami w zakresie między 0,15 a 0,28.

Na podstawie analizy mocy opisanej powyżej n=25 na kohortę zapewnia wystarczającą moc (P≥0,95). Aby płynnie poradzić sobie z ewentualnymi błędami przedanalitycznymi, przeprowadzić późniejszą walidację i analizy kontrolne, kohorty zostały zdublowane.

Rejestry pacjentów

Dane identyfikacyjne poszczególnych uczestników zebrane podczas IHD-EPITRAN będą przechowywane głównie w formie elektrycznej na sieciowych dyskach twardych HUS i Tays, które są chronione prawami dostępu opartymi na rolach. Dla IHD-EPITRAN tworzone są dwa oddzielne rejestry: (1) Rejestr kluczy, który zawiera wszystkie informacje identyfikujące uczestnika oraz powiązania między kodami pseudonimizacji, które są używane w (2) Rejestrze badań (w pełni pseudonimizowanym), który zawiera wszystkie inne zebrane informacje o badaniach od uczestników. Antti Vento, dyrektor IHD-EPITRAN, posiada prawa dostępu do Rejestru Kluczy. Rejestry są przechowywane przez 10 lat, aby umożliwić ewentualne późniejsze projekty uzupełniające.

Dokumenty opisujące przetwarzanie dla obu rejestrów, wraz z dokumentem samooceny ryzyka związanego z badaniem, zostały stworzone dla IHD-EPITRAN w języku fińskim. Dokumenty te zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Radę ds. Etyki Okręgu Szpitalnego w Helsinkach i Uusimaa (Dnr. HUS/1211/2020).

Grupa poszukiwawcza

Docent Antti Vento jest dyrektorem zarówno projektu IHD-EPITRAN, jak i Centrum Serca i Płuc HUS. Interdyscyplinarny zespół składający się z klinicystów, badaczy podstawowych i ekspertów analitycznych umożliwia IHD-EPITRAN synergiczne przeprowadzanie rekrutacji, pobierania i przygotowywania próbek, a następnie analiz bioinformatycznych krajobrazu epitranskryptomicznego krążącego RNA w IHD. Docentowie Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala i Satu Suihko, wszyscy kardiolodzy ze stacji kardiologicznej HUS, przeprowadzą rekrutację pacjentów na tomografię komputerową, analizy obrazowe, leczenie pacjentów z zawałem mięśnia sercowego oraz, po trzecie, wizyty kontrolne pacjentów z zawałem mięśnia sercowego, CABG i AVR . Kardiolog i chirurg naczyniowy Kari Teittinen z Centrum Serca i Płuc HUS wraz z kardiochirurgiem dr Jahangirem Khanem i profesorem Jari Laurikką ze szpitala Tays Heart Hospital przeprowadzają rekrutację pacjentów po CABG i AVR oraz ich operacje. Pielęgniarki badawcze Kati Oksaharju i Kati Helleharju, odpowiednio z HUS Heart and Lung Center i Tays Heart Hospital, koordynują rekrutację pacjentów oraz, w ścisłej współpracy z laborantką Lahją Eurajoki, pobieranie próbek, transport i natychmiastowe przechowywanie po zamrożeniu. Projekt będzie realizowany w laboratorium docenta Esko Kankuri i profesora Eero Mervaala (Uniwersytet Helsiński, CardioReg Group, Department of Pharmacology). BM Vilbert Sikorski i mgr Daria Błochina wspólnie przeprowadzą izolację RNA, frakcjonowanie, analizę UHPLC-LC-MS/MS i sformułowanie protokołu. Ponadto Sikorski wspólnie zaplanował protokół badania z innymi współautorami IHD-EPITRAN, wystąpił o pozwolenia na badania i nadal koordynuje wymianę informacji między współpracownikami oraz prowadzi pisanie artykułów z wynikami ze współautorami.

Etyka

Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki HUS (Dnr. HUS/1211/2020). Odpowiednie rady regionalne i krajowe ocenią następnie protokół wieloośrodkowego pobierania próbek. Należy zadbać o to, aby każdy uczestnik badania miał wystarczająco dużo czasu na zapoznanie się z protokołem badania. Następnie odbędzie się dyskusja na temat świadomej zgody i uzyskana zostanie pisemna świadoma zgoda uczestnika.