관상 동맥 질환에 대한 Epitranscriptomic Blood Biomarkers - 전향적 코호트 연구(IHD-EPITRAN) (IHD-EPITRAN)

배경 - 허혈성 심장 질환

전 세계적으로 1억 2,650만 명의 유병률과 연간 890만 명의 사망률을 보이는 허혈성 심장 질환(IHD)이 주요 사망 원인입니다(GBD Collaborators 2017). IHD는 관상 동맥 벽에 지질이 축적되는 진행 중인 죽종형성의 결과로 발생합니다. 결국, 콜레스테롤과 칼슘의 축적은 혈관 내강을 좁히는 침전물, 즉 플라크를 형성합니다. 심근 경색(MI)이 시작되면 이러한 플라크가 파열되어 혈관의 혈액 공급에 의존하는 심근의 무산소 사망으로 이어집니다. 단기적으로는 딱딱한 흉터가 형성되어 심장의 기능이 회복됩니다. 시간이 지남에 따라 펌핑 기능은 일반적으로 심부전(HF)으로 악화됩니다.

최적으로, 질병 바이오마커는 혈액에서 분석되어 질병 진행, 중증도에 대한 통찰력을 제공하고 치료 효능 평가를 돕습니다. 불행하게도, IHD에 대한 최적의 바이오마커는 현재까지 확인되지 않았습니다. IHD 바이오마커에 대한 필요성을 강조하는 진단되지 않은 IHD를 가지고 살고 조기 진단의 혜택을 받는 수많은 사람들의 수는 셀 수 없습니다.

배경 - Epitranscriptomics

RNA의 전사후 변형 분야인 Epitranscriptomics는 DNA 후생유전학과 유사하며 최근 더 많은 과학적 주목을 받고 있습니다(Saletore 2012). 이 확장된 분야는 세포 증식에서 죽음에 이르는 과정을 제어하는 ​​생물학적 조절의 새로운 계층을 발견하고 있습니다.

RNA 종에서 170개 이상의 RNA 변형이 확인되었지만(Yang 2018), 질소-6 위치(m6A)의 아데노신 메틸화는 가장 흔하고 집중적으로 연구된 것 중 하나입니다(Liu 2020). 1970년대에 m6A 메틸화된 mRNA의 초기 발견에 이어(Desrosiers 1974), epitranscriptomics는 m6A를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 생체 내 방법의 개발과 함께 지난 10년 동안 다시 점화되었습니다(Dominissini 2012). 이러한 초기 면역 침전 기반 방법론(즉, meRIP-seq)는 특정 m6A 문장 부호 패턴과 특별히 표시된 작성기(메틸트랜스퍼라제, METTL3/14/WTAP1 복합체 및 METTL16), 판독기(결합 단백질, 예: YTH-단백질 계열) 및 지우개(데메틸라제; ALKBH5; Zaccara 2019).

YTH 도메인 패밀리의 m6A 효과를 중재하는 여러 독자가 확인되었습니다. YTHDF1-3은 각각 mRNA 번역, 분해 또는 둘 다를 촉진합니다. YTHDC1-2, eIF2, METTL3 및 리보솜은 m6A도 인식하고 번역 및 세포질 구획화를 촉진합니다(Zaccara 2019).

m6A 수준의 변화는 암, 심혈관 및 신경 장애를 포함한 수많은 병리와 관련이 있습니다(Frye 2016). m6A 작성기와 지우개의 녹아웃과 과발현을 모두 사용한 연구에서 면역 반응성, 세포 증식, 이동 및 세포 사멸을 유도하는 역할이 밝혀졌습니다(Delaunay 2019).

배경 - Epitranscriptomics & 심장

최근에 발표된 일련의 연구에서는 고혈압(Jain 2018), 신생혈관 형성(Kwast 2019) 동안 m6A 및 A-to-I 편집(아데노신-이노신, 염기쌍을 변경하여 전사체를 다양화하는 또 다른 일반적인 수정)의 역할을 제안합니다. , 심근 비대(Dorn 2019, Kmietczyk 2019), 허혈(Mathiyalagan 2019) 및 HF(Berulava 2020). 일련의 증거가 심장 건강 및 질병의 원인으로 epitranscriptomics를 나타내지만 모든 초기 연구는 심근에 초점을 맞췄습니다.

근거, 목적 및 중요성

우리는 IHD의 병태생리학이 순환하는 RNA의 epitranscriptome에 반영된다는 가설을 세웁니다. 예를 들어, 리보솜 RNA는 반감기가 길고 관상 순환에서의 변형은 심장 상태에 반응할 수 있습니다.

IHD-ERPITRAN 프로젝트의 목적은 다음과 같습니다. (1) epitranscriptomic 바이오마커에 대한 스크리닝 프로토콜 설정, (2) IHD 병리생리학에 대한 epitranscriptomic 통찰력 제공, (3) 일련의 IHD 바이오마커 후보 식별 및 (4) 치료를 위한 열린 길 연구 부족과 방법론적 한계로 인해 이전에는 무시되었던 개발. 예를 들어, 우리 연구 그룹은 RNA 메틸 전이 효소에 대한 소분자 리간드의 발견을 보고했습니다(Selberg 2019).

epitranscriptomics는 심장에서 조절 역할을 하는 것으로 제안되었고 IHD-EPITRAN은 IHD에서 epitranscriptomic 혈액 바이오마커를 평가하는 최초의 제품 중 하나이므로 이 프로젝트는 예상되는 글로벌 임상 이점과 함께 과학적 돌파구의 열쇠를 쥐고 있습니다.

행동 양식

연구 코호트 - 200명의 환자를 각각 50명의 환자를 세는 4개의 코호트로 모집합니다. 첫 번째 코호트는 경피적 관상동맥 중재술(PCI)로 재혈관화된 급성 MI로 Heart Unit에 제시하는 환자로 구성되며, 급성 IHD 표현형이 혈액 epitranscriptome에 미러링되는 방식에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 코호트입니다. 둘째, 이 프로젝트의 주요 연구 코호트는 관상동맥우회술(CABG)로 치료받은 안정적인 IHD 표현형을 가진 환자들로 구성될 것이며 만성 허혈 및 관상동맥 죽종형성과 관련하여 중요한 정보를 제공할 것입니다. IHD. 셋째, IHD가 없는 협착증으로 인해 AVR(대동맥판막 치환술) 치료가 예정된 환자는 다른 심장 병리를 가진 양성 대조군을 제공하고, 넷째, 관상동맥 컴퓨터 단층촬영(CT)으로 확인된 건강한 non-IHD 환자와 함께 양성 대조군을 제공합니다. ), 프로젝트의 제어 코호트를 형성합니다.

연구 샘플 - IHD-EPITRAN은 각각 두 번 수집된 TEMPUS(TM) 및 EDTA 혈액 샘플에서 혈액 세포 및 무세포 RNA 에피전사체를 발견합니다. 또한, MI 및 CABG 코호트의 경우 우심방이 조직 샘플의 epitranscriptome을 기준점으로 해독합니다. 마지막으로, 보충적인 HF 및 IHD 바이오마커 세트: NT-proBNP, hsCRP, sST2 및 TMAO(Aimo 2019, Ahmadmehrabi 2017 및 Tibaut 2019)를 측정합니다.

RNA 방법 - 실험실에서 검증된 방법으로 RNA를 분리하고 분획한 다음에는 UHPLC-삼중 사중극자 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 시스템을 활용하여 7가지 염기 변형의 정량 분석을 수행합니다(Selberg 2019). 정량 분석 ​​후 m6A 표지가 풍부한 항 m6A 항체 기반 RNA 사전 선택과 함께 시퀀싱, 즉 meRIP-seq가 수행됩니다. 궁극적으로 UHPLC-LC-MS/MS 및 meRIP-seq 이후에 Liu 등이 최근에 개발한 새로운 알고리즘을 사용하여 네이티브 시퀀스에서 m6A 마크를 식별할 수 있는 직접 nanopore long-read 시퀀싱을 수행합니다. (2019). 이 알고리즘은 특정 단백질 나노포어를 통해 흐르는 m6A에 의한 전류의 특징적인 중단 인식을 기반으로 합니다.

DNA 시퀀싱 - A-to-I RNA 편집 이벤트를 식별하기 위해 모든 연구 참여자에 대해 전체 게놈 차세대 시퀀싱을 수행하여 일치하는 DNA-to-RNA 염기 비교를 가능하게 합니다(Park et al., 2012).

생물 정보학 - 시퀀싱에서 얻은 방대한 데이터 세트를 해석하기 위해 Folkhälsan(Karolinska Institutet, Dr. Shintaro Katayma) 및 중동 기술 대학(Nurcan Tuncbag 교수)의 생물 정보학 팀과 공동으로 생물 정보학 프로토콜을 개발했습니다. 시퀀스는 알려진 전사 라이브러리에 대해 평가됩니다.

임상 방법 - 심초음파는 심장의 기능적 상태에 대한 통찰력을 제공하며 초기 입원 기간과 PCI, CABG 또는 AVR 후 3개월 모두에 미리 지정된 매개변수로 수행됩니다. 이러한 심장 전문의의 진료에는 각각 CCS 및 NYHA 등급으로 협심증 및 운동성 호흡곤란의 중증도 평가가 포함됩니다. 또한 표준화된 약식 36 건강 설문조사를 통한 이환율 자가 평가가 포함됩니다. 또한, 수술 전후 6개월의 심혈관 건강과 관련된 입원, 사망 및 약물 변경을 포함한 환자 기록 시스템 검색을 수집합니다.

검정력 분석 - 코호트 크기는 RNAseq 실험에 대한 통계 검정력을 평가하기 위해 설계된 RNAseqPS 웹 도구로 결정되었습니다(Guo et al., 2014). 사용된 매개변수 값(거짓 발견률[FDR] <0.05, 테스트를 위한 총 유전자 수 20,000, 예측된 예후 유전자 1500, 차등 발현에 대한 최소 접힘 변화 임계값 2 및 예후 유전자에 대한 평균 판독 횟수 10)는 적용 가능한 HF 동안 epitranscriptomics에 관한 보고서(Berulava et al., 2020). 0,215의 예후 유전자 분산 값은 공개적으로 사용 가능한 10개의 RNA-seq 데이터 세트의 분산을 분석한 Yoon & Nam 2017의 문제에 초점을 맞춘 기사를 기반으로 적용되었으며, 이 중 4개는 분산 범위가 있는 IHD-EPITRAN에 적용 가능한 관련 없는 복제를 반영했습니다. 0.15에서 0.28 사이.

위에서 설명한 전력 분석을 기반으로 코호트당 n=25는 충분한 전력을 제공합니다(P≥0,95). 가능한 사전 분석 오류를 유창하게 해결하고 후속 검증 및 후속 분석을 수행하기 위해 코호트를 두 배로 늘렸습니다.

환자 등록

IHD-EPITRAN 동안 수집된 개별 참가자 식별 정보 데이터는 주로 역할 기반 액세스 권한으로 보호되는 HUS 및 Tays의 네트워크 하드 드라이브에 전기 형식으로 저장됩니다. IHD-EPITRAN에 대해 두 개의 별도 레지스트리가 생성됩니다. (1) 모든 참가자 식별 정보를 포함하는 키 레지스트리와 (2) 다른 모든 수집된 연구 정보를 포함하는 연구 레지스트리(완전히 가명 처리됨)에서 사용되는 가명 코드 사이의 링크 참가자들로부터. IHD-EPITRAN의 책임자인 Antti Vento는 키 레지스트리에 대한 액세스 권한을 가집니다. 레지스트리는 향후 후속 프로젝트가 가능하도록 10년 동안 저장됩니다.

연구 위험에 대한 자체 평가 문서와 함께 두 레지스트리에 대한 처리 설명 문서가 IHD-EPITRAN용으로 핀란드어로 작성되었습니다. 이 문서는 헬싱키 및 Uusimaa 병원 지구 윤리 위원회(Dnr. HUS/1211/2020).

연구 그룹

Docent Antti Vento는 IHD-EPITRAN 프로젝트와 HUS 심장 및 폐 센터의 책임자입니다. 임상의, 기본 연구원 및 분석 전문가로 구성된 학제간 팀은 IHD-EPITRAN이 상승적으로 모집, 샘플 수집 및 준비를 수행한 다음 IHD에서 순환하는 RNA의 epitranscriptomic 풍경에 대한 생물정보학적 분석을 수행할 수 있도록 합니다. HUS 심장 스테이션의 모든 심장병 전문의인 Mika Laine, Pasi Karjalainen, Helena Rajala 및 Satu Suihko가 CT 환자 모집, 영상 분석, MI 환자 치료, 세 번째로 MI, CABG 및 AVR 환자 통제 예약을 수행합니다. . HUS 심장 및 폐 센터의 심장 및 혈관 외과의 Kari Teittinen은 Tays Heart Hospital의 심장 흉부 외과의 Jahangir Khan PhD 및 Jari Laurikka 교수와 함께 CABG 및 AVR 환자 모집 및 수술을 수행합니다. HUS Heart and Lung Center와 Tays Heart Hospital의 연구 간호사 Kati Oksaharju와 Kati Helleharju는 각각 환자 모집을 조정하고 Lahja Eurajoki와 긴밀히 협력하여 샘플 수집, 운송 및 동결 후 신속한 보관을 담당합니다. 이 프로젝트는 도슨트 Esko Kankuri와 Eero Mervaala 교수(University of Helsinki, CardioReg Group, Department of Pharmacology)의 실험실에서 수행됩니다. B.M. Vilbert Sikorski와 MSc Daria Blokhina는 공동으로 RNA 분리, 분류, UHPLC-LC-MS/MS 분석 및 프로토콜 문서 구성을 수행할 것입니다. 또한 Sikorski는 다른 IHD-EPITRAN 공동 저자와 공동으로 연구 프로토콜을 계획하고 연구 허가를 적용했으며 공동 작업자 간의 정보 교환을 계속 조정하고 공동 저자와 결과 기사 작성을 수행합니다.

윤리학

이 연구는 HUS Ethics Board(Dnr. HUS/1211/2020). 각 지역 및 국가 위원회는 이후 다기관 샘플 수집에 대한 프로토콜을 평가합니다. 각 연구 참가자가 연구 프로토콜에 익숙해질 수 있는 충분한 시간을 갖도록 주의를 기울일 것입니다. 그 후, 정보에 입각한 동의 토론이 열리고 참가자로부터 서면 동의를 얻습니다.