Studio di prova di concetto e di validazione del test diagnostico rapido per l'antigene della Leishmania

La leishmaniosi viscerale (VL) o kala azar è una malattia tropicale trascurata (NTD) causata da parassiti protozoari del complesso Leishmania donovani trasmessi dai flebotomi. Si stima che ogni anno nel mondo si verifichino tra 50.000 e 90.000 nuovi casi. È caratterizzata da febbre, perdita di peso, ingrossamento della milza e del fegato e anemia e può essere fatale in oltre il 95% dei casi senza trattamento. Il Corno d’Africa rappresenta il maggior numero di casi di VL in tutto il mondo e le comunità che vivono in ambienti remoti e con risorse limitate sono quelle a maggior rischio di infezione. Pertanto, è essenziale una diagnosi precoce e accurata della VL nelle strutture sanitarie. La VL è fatale se non viene adeguatamente trattata. I farmaci attualmente utilizzati per trattare la VL possono avere gravi effetti collaterali e la presentazione clinica della VL non è sufficientemente specifica per guidare il trattamento. Test diagnostici rapidi (RDT) altamente accurati (sia sensibili che specifici), economici e semplici sono quindi cruciali per la gestione dei casi di VL. Anche la diagnosi precoce dei casi seguita da un trattamento adeguato è fondamentale per il controllo della VL.

In Kenya, la leishmaniosi viscerale viene diagnosticata dall'RDT rK39 sulla base del rilevamento dell'anticorpo dell'ospite contro un antigene leishmaniale ricombinante ripetuto con 39 aminoacidi in casi clinicamente sospetti. Poiché questo test ha una sensibilità non ottimale pari a circa l'85%, spesso sono necessari altri test diagnostici aggiuntivi. Questi includono il test di agglutinazione diretta (DAT) basato sull'agglutinazione dell'intero antigene del parassita mediante anticorpi ospiti specifici del parassita e il rilevamento al microscopio di amastigoti in strisci colorati ottenuti da punture linfonodali, aspirati di midollo osseo o di milza, attualmente il gold standard per la diagnosi di conferma.

Sebbene l'uso di rK39 RDT e DAT sia in aumento, i test non sono in grado di distinguere le infezioni attive da quelle pregresse poiché si basano sul rilevamento di anticorpi antileishmania presenti sia nelle infezioni attive che in quelle pregresse. Inoltre, il DAT richiede alcune competenze di laboratorio e incubazioni notturne prima di ottenere i risultati e l'rK39 ha una bassa sensibilità se utilizzato nell'Africa orientale. Sono stati quindi compiuti sforzi per sviluppare un test basato sul rilevamento dell'antigene basato sulla raccolta di campioni minimamente invasivi come sangue o urina.

A tal fine, una collaborazione tra KEMRI, DNDi, FIND e l’Università di York nell’ambito del progetto Next generation diagnostics and orale trattamento per la leishmaniosi viscerale in Africa orientale: trasformare la cura dei pazienti attraverso l’innovazione (VL-INNO) EDCTP, mira a sviluppare un antigene test diagnostico basato sui biomarcatori dei parassiti nelle urine e nel sangue di pazienti affetti da VL. In questo progetto, verrà utilizzato un approccio proteomico per identificare gli antigeni candidati della Leishmania presenti nel sangue e nelle urine dei soggetti affetti da leishmaniosi viscerale confermata. L'Università di York effettuerà analisi proteomiche dei campioni utilizzando lo spettrometro di massa a triplo quadrupolo (LCMS/MS) con cromatografo liquido altamente sensibile per esplorare la diversità antigenica in campioni clinici archiviati definiti (sangue, urina) di pazienti affetti da VL prima e dopo il trattamento. Sulla base della resa, della stabilità e dell'immunogenicità degli antigeni, verranno prodotti anticorpi monoclonali (mAb) per il successivo sviluppo di un prototipo di test diagnostico rapido (RDT) a flusso laterale in grado di rilevare antigeni della leishmania nel sangue e/o nelle urine di pazienti affetti da VL.

Con queste attività avviate utilizzando campioni precedentemente raccolti da pazienti affetti da VL in Kenya, il presente protocollo mira a raccogliere campioni (sangue e urina) da due centri di trattamento per VL, vale a dire l'ospedale della sottocontea di Chemolingot nella contea di Baringo e la sottocontea di Kacheliba, West Pokot, per essere utilizzato nella valutazione del prototipo RDT. Analizzeremo campioni di pazienti affetti da VL raccolti prima e alla fine del trattamento, per determinare la sensibilità del test e come cambia l'abbondanza dell'antigene parassitario nelle urine e nel sangue in conseguenza della guarigione clinica. Verranno utilizzati campioni provenienti da controlli endemici sani per determinare la specificità del test.