Biomarcadores pulmonares PGD em doadores de órgãos

A disfunção primária do enxerto (PGD) é responsável pela alta mortalidade precoce em pacientes transplantados pulmonares.

Justificativa

A evolução do transplante pulmonar pode ser complicada pela disfunção primária do enxerto (PGD), uma forma de síndrome do desconforto respiratório agudo causada por fenômenos relacionados à isquemia-reperfusão. O PGD ocorre em 15-50% dos casos e é responsável por um aumento significativo na mortalidade, duração da ventilação assistida e tempo de internação em terapia intensiva. É também um importante fator de risco para o desenvolvimento a médio prazo de rejeição aguda e de longo prazo, da síndrome de bronquiolite obliterante (SBO) - rejeição crônica - que reduz drasticamente a sobrevida do enxerto.

As proteínas surfactantes compreendendo a proteína secretora das células Clara (proteína celular Clara de 16 kd-CC16) e as proteínas surfactantes -A (SP-A), -B (SP-B) e -D (SP-D) são reconhecidas como marcadores de a permeabilidade da barreira alvéolo-capilar.

Com base nesses achados, postulamos que a expressão gênica de CC16, SP-A, -B e D está alterada em biópsias pulmonares realizadas em doadores de pacientes que desenvolveram disfunção primária do enxerto após transplante pulmonar em comparação com aquelas realizadas em doadores de pacientes livres de esta síndrome.

Este estudo poderia, portanto, ser um meio complementar de avaliação objetiva da qualidade pulmonar antes do transplante.

Propósitos e objectivos

1. Descrever, no doador de órgãos, alterações na expressão da Clara Cell Protein (CC16), proteínas associadas ao surfactante (A, B ou D), citocinas pró e anti-inflamatórias no sangue circulante e no tecido pulmonar durante a recuperação do órgão.
2. Descrever as alterações biológicas e estruturais após o período de isquemia fria.
3. Estabelecer uma correlação entre biomarcadores no doador de órgãos e a ocorrência de disfunção aguda do enxerto no receptor de pulmão.

Material e método

Critério de inclusão

Todos os pacientes doadores de órgãos pulmonares encaminhados para nossa rede e seus receptores serão incluídos após obtenção de seu consentimento informado.

Coleção de dados

No doador, registraremos dados demográficos (idade, sexo), história, causa da morte, gasometria, protocolo de radiografia de tórax, parâmetros biológicos sanguíneos, duração da morte encefálica se for o caso e tempo de isquemia quente se for o caso e protocolo de análises bacteriológicas.

No receptor, registraremos os dados demográficos (idade, sexo), indicação do transplante, resultados do cateterismo direito realizado no pré-transplante, dados intraoperatórios padrão, imunossupressão, gasometria, protocolo de radiografia de tórax, equilíbrio de enchimento e sangue biológico parâmetros em 24, 48 e 72h. Os tempos de desaperto são registrados.

Os pacientes são automaticamente acompanhados pelo resto de suas vidas. Biópsias iterativas são realizadas no primeiro ano para detectar possível rejeição aguda. Os dados serão incluídos em nosso estudo.

Amostras biológicas

No doador, antes da perfusão das soluções de preservação, são retirados 18 cc de sangue periférico (tubo seco, 9 cc). 1 tubo será armazenado a -80°C, o outro será centrifugado (15 minutos, 10000/min, 20°C.) e em seguida o soro será armazenado a -80°C.

Imediatamente após a recuperação pulmonar, uma biópsia pulmonar (6 cm2) é realizada nos lobos inferiores.

Um fragmento será imediatamente colocado em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C. Um segundo fragmento será armazenado em formol por 24h e posteriormente armazenado em blocos de parafina.

Antes do implante, ao final do período de preservação, é realizada nova biópsia pulmonar nos lobos inferiores.

análises biológicas

Exame histológico e gradação

Os tecidos pulmonares fixados em formalina são corados com hematoxilina-eosina para graduar as lesões pulmonares [(1) infiltração de neutrófilos, (2) danos nas células epiteliais das vias aéreas, (3) edema intersticial, (4) membrana hialina e (5) hemorragia].

Inflamação, apoptose e proteínas surfactantes

O Medições de mRNA tecidual: PCR de quantificação em tempo real (RTQ-PCR)

O Medições de peptídeos teciduais: Western Blot - ELISA - MILLIPLEX

O Tratamento de amostras de sangue e análises: ELISA - MILLIPLEX

Citocinas inflamatórias de proteínas (TNF-alfa, IL-6, IL-8, IL-1, IL33) (IL-10), moléculas de adesão intercelular (ICAM-1, VCAM-1), apoptose (Bax, Bcl2, Caspases)

Avaliação da apoptose: TUNEL - Imuno-histoquímica