Prospektivní studie molekulární detekce zachránitelného časně recidivujícího nasofaryngeálního karcinomu po radioterapii

1. Pozadí: Selhání léčby může nastat na vzdálených místech, která dosud nemají účinnou léčbu. Časné lokální reziduální nebo rekurentní NPC lze zachránit s více než 50% 5letou mírou přežití. Je však obtížné klinicky detekovat časnou reziduální nebo recidivující NPC po radioterapii nasoendoskopií v silně ozařovaném nosohltanu s těžkou nazofaryngitidou a zánětlivým otokem a krustovými změnami. Radiologické zobrazování a nazofaryngeální biopsie mají svou roli, jsou však invazivní, nákladné a nelze je často opakovat jako rutinní kontrolní screeningová metoda. Bohužel 50 % lokálních recidiv je v pokročilém stádiu rT3-4 a 28 % lokálních recidiv nelze zachránit. Pro úspěšnou záchrannou léčbu je proto důležitá detekce časného stadia reziduálních/rekurentních NPC, které naše konvenční klinické sledování vynechalo. Neinvazivní, levný a opakovatelný odběr krve a nazofaryngeálního kartáčku/výtěru pro molekulární detekci NPC je naším výzkumným cílem pro budoucí zlepšení výsledků léčby lokálního selhání.

Existují dva potenciální molekulární markery detekce minimálních reziduálních/rekurentních NPC.

1. EBV DNA je molekulární marker pro NPC. Uvedli jsme, že pouze 61 % pacientů s lokální recidivou podstupujících nazofaryngektomii mělo pozitivní plazmatickou EBV DNA. Senzitivita byla nižší u lokální recidivy ve srovnání se stejným stádiem u NPC před léčbou, 86 % T1 oproti 38 % rT1. EBV DNA v nazofaryngeálním kartáčku byla před léčbou 96% citlivá a 96% specifická pro NPC. EBV DNA ve výtěru z nosohltanu po radioterapii zmizela a znovu se objevila se slizniční lokální recidivou se 100% senzitivitou a 98% specificitou v malé případové studii 11 pacientů s lokálními recidivami, výsledky ukazují její potenciální detekci lokálních recidiv, které jsou minul naše konvenční sledování. Vyžaduje však další prospektivní longitudinální studii pro ověření.
2. Bylo zjištěno, že methylace oblasti promotoru bohaté na CG mnoha tumor supresorových genů je běžnou genetickou abnormalitou u NPC, ale ne v normálním nosohltanu. Ukázali jsme, že metylovaná promotorová DNA je detekovatelná v periferní krvi a nasofaryngeálním výtěru pacientů s NPC, ale zřídka u normálních kontrol. Při použití kombinace 3 metylovaných genů v plazmě jsme zjistili 38% senzitivitu pro detekci lokální recidivy.

2. Cíl studie Vyhodnotit senzitivitu a specificitu kombinace genů EBV a methylačních markerů v tělesných tekutinách plazmy a nazofaryngeálního kartáčku společně pro screening časně zachránitelných lokálních reziduálních a rekurentních NPC, které konvenční protokol klinického sledování opomenul.

3. Testovaná hypotéza:

1. Pacienti v remisi bez reziduálního nebo recidivujícího tumoru po léčbě by měli mít při sledování trvale negativní nebo velmi nízké základní hladiny markerů jak v nazofaryngeálním kartáčku, tak v plazmě.
2. Pacienti s reziduálními nebo recidivujícími lokálními nebo nodálními nádory mají buď trvale vysokou hladinu markerů po 8. týdnu, nebo počáteční vymizení/snížení na velmi nízkou úroveň pozadí, po kterém se znovu objeví/zvýšení hladiny markerů při sledování. Časová změna v množství markerů je důležitá pro zohlednění nádorové zátěže reziduálních a rekurentních NPC před klinickou prezentací. Předpokládáme, že tento vzorec bude pozorován u pacientů s reziduálním/rekurentním NPC v časných stadiích, které lze zachránit před klinickou prezentací.

4. Metodika studia:

1. Před léčbou

   1. Pod endoskopickým vedením se odebírá nasofaryngeální kartáček nádoru.
   2. Vzorek biopsie NPC se pak odebere pro histologický řez a také se čerstvě zmrazí v kapalném dusíku a uloží do mrazáku -80C pro následnou studii.
   3. Pro studii se také odebere 20 ml krve EDTA.
   4. EBV DNA a metylační markery budou vyšetřeny v nádoru, nazofaryngeálním kartáčku a krvi pomocí metylačně specifické kvantitativní PCR metody. Laboratorní protokoly byly uvedeny z našich předchozích publikací o EBV DNA a metylačních studiích.

2. Přehodnocení zbytkového NPC po ošetření

   1. Na základě námi publikovaných výsledků studie doby remise reziduálního NPC po léčbě máme náš rutinní sledovací protokol k provedení endoskopického vyšetření a náhodné biopsie nosohltanu v 8. týdnu po léčbě pro hodnocení reziduálního NPC.
   2. V době endoskopie v 8. týdnu bude odebrán nazofaryngeální kartáček a 20 ml krve pro studium biomarkerů. EBV a specifické methylační markery pacienta vybrané z nálezů biopsie nádoru pacienta budou použity pro každého jednotlivého pacienta ke screeningu reziduálního NPC.
   3. U pacientů, kteří mají pozitivní biopsii v 8. týdnu, bude opakovaná biopsie provedena v 10. týdnu. Pokud je biopsie v 10. týdnu stále pozitivní, bude zajištěna záchranná léčba buď reiradiací, nebo nazofaryngektomií podle potřeby. Pokud bude opakovaná biopsie v 10. týdnu negativní, pacient bude znovu posouzen za 4 týdny.
   4. U pacientů s negativním nálezem biomarkerů i biopsie v 8. týdnu bude pacient sledován podle plánu měsíčně.
   5. U těch pacientů, kteří mají pozitivní biomarkery, ale negativní biopsii v 8. týdnu, budou v 10. týdnu provedeny další nazofaryngeální biopsie, aby se zajistilo, že v 8. týdnu nechybí lokální reziduální NPC z předchozí biopsie. V tuto chvíli bude také prováděno radiologické zobrazování. Nasofaryngeální kartáček a krevní testy budou také opakovány, aby bylo možné sledovat časovou změnu v čase. Pacientům, kteří mají pozitivní biopsii v 10. týdnu, bude poskytnuta vhodná záchranná léčba radioterapie nebo chirurgický zákrok a tito pacienti mají prospěch z molekulárního screeningu. Pacienti, kteří mají trvale negativní biopsii v 10. týdnu, budou sledováni podle plánu, a pokud nedojde k recidivě při sledování, mají tito pacienti falešně pozitivní molekulární dohled.

3. Následné sledování pro detekci opakujících se NPC

   1. Pacient, který má po léčbě negativní biopsii nosohltanu v 8./10. týdnu, bude sledován každý měsíc v prvním roce, každé 2 měsíce ve druhém roce a každé 3 měsíce ve třetím - pátém roce po dobu celkem 5 let. Očekává se, že u 11 % z nich ve skutečnosti dojde následně k lokální recidivě. Naším rutinním protokolem je provádění nasoendoskopie k vyšetření nosohltanu během každého sledování. Pokud není v nosohltanu patrná žádná podezřelá léze, biopsie nebude provedena a pacient bude přeplánován na kontrolu.
   2. Biopsie nosohltanu bude provedena, pokud je během kontrolní endoskopie pozorována podezřelá léze. Pokud se biopsie prokáže jako recidiva, bude pacient podle toho léčen. Pokud je biopsie negativní, bude pacient přeplánován na pravidelné kontroly.

   3. Nasofaryngeální kartáček a 20 ml krve bude odebráno při kontrole každé 2 měsíce v 1. a 2. roce a každé 3 měsíce ve 3. až 5. roce pro studium.

      EBV a specifické metylační markery pacienta vybrané z nálezů biopsie nádoru pacienta budou znovu posouzeny u každého jednotlivého pacienta za účelem screeningu lokální recidivy.

   4. Pokud má pacient negativní nasoendoskopický nález a negativní nález molekulárních biomarkerů v plazmě i nazofaryngeálním kartáčku, bude pacient pravidelně sledován podle plánu.
   5. Pokud má pacient negativní nasoendoskopický nález, ale pozitivní výsledek molekulárního markeru je nalezen alespoň v jedné tělní tekutině nebo markeru, bude pacient důkladně znovu posouzen na recidivu, kterou během rutinního klinického sledování přehlédneme. Pacientovi bude provedeno PET/CT/MRI zobrazení a náhodné vícenásobné biopsie z nosohltanu, aby bylo možné posoudit možnou lokální recidivu. Vzhledem k tomu, že pozitivní nález v plazmě může být způsoben uzlinovými nebo vzdálenými metastázami, budou vyšetřena další místa recidivy nebo nového karcinomu, jak se klinicky považuje za nezbytné. Pokud je biopsie z nosohltanu pozitivní nebo je zjištěno jiné místo recidivy, bude pacient podle potřeby ošetřen záchrannou léčbou. Tito pacienti mají prospěch z molekulárního dozoru se skutečně pozitivním výsledkem. Pokud jsou všechny nálezy recidivy negativní, bude pacient přeplánován na pravidelné sledování, a pokud se u pacienta při dalším sledování neprokáže žádná recidiva, je molekulární dohled považován za falešně pozitivní.
4. Koncový bod sledování Stav sledování po 5 letech bude naším konečným bodem studie pro každého pacienta.
5. Počet přijatých pacientů a kritéria náboru:

V Queen Mary Hospital je ročně 130-150 nových NPC pacientů. Plánujeme přijmout 350 pacientů pro longitudinální studii počínaje lednem 2006. Přijatí pacienti by měli být před léčbou zdravotně způsobilí pro kurativní radioterapii bez vzdálených metastáz. Očekává se, že v roce 2008 bude přijato celkem 350 pacientů. Očekáváme, že z těchto 350 pacientů uvidíme asi 35 pacientů, u kterých se pomocí zobrazovacího a bioptického vyšetření v 8. týdnu po radioterapii s konvenčním sledováním nezjistí žádný reziduální lokální nádor, ale následně se vyvine izolovaná lokální recidiva během 5 let sledování . Byli bychom schopni vědět, kolik z těchto lokálních recidiv bude přínosem z včasné detekce s molekulárním dohledem, jejich stádium recidivy a výsledek léčby. Z těchto 350 pacientů očekáváme asi 20 pacientů s recidivou uzlin.