Uno studio prospettico sulla rilevazione molecolare del carcinoma rinofaringeo ricorrente precoce recuperabile dopo la radioterapia

1. Sfondo: il fallimento del trattamento può verificarsi in siti distanti che non hanno ancora una cura efficace. Gli NPC locali residui o ricorrenti precoci sono recuperabili con un tasso di sopravvivenza a 5 anni superiore al 50%. È tuttavia difficile rilevare clinicamente NPC residuo precoce o ricorrente dopo radioterapia mediante rinoendoscopia nel rinofaringe fortemente irradiato con nasofaringite grave e gonfiore infiammatorio e alterazioni della formazione di croste. L'imaging radiologico e la biopsia rinofaringea hanno il loro ruolo, ma sono invasivi, costosi e non possono essere ripetuti spesso come metodo di screening di follow-up di routine. Sfortunatamente, il 50% delle recidive locali sono in fase avanzata rT3-4 e il 28% delle recidive locali non sono recuperabili. Pertanto, il rilevamento dell'NPC residuo/ricorrente in fase iniziale che viene perso dal nostro follow-up clinico convenzionale è importante per il successo del trattamento di salvataggio. Il campionamento non invasivo, economico e ripetibile di sangue e pennello/tampone rinofaringeo per il rilevamento molecolare di NPC è il nostro obiettivo di ricerca per il futuro miglioramento del risultato del trattamento del fallimento locale.

Esistono due potenziali marcatori molecolari di rilevamento di NPC minimo residuo/ricorrente.

1. Il DNA di EBV è un marcatore molecolare per NPC. Abbiamo riportato che solo il 61% dei pazienti con recidiva locale sottoposti a rinofaringectomia presentava DNA EBV plasmatico positivo. La sensibilità era inferiore nella recidiva locale rispetto allo stesso stadio nel pretrattamento NPC, 86% T1 contro 38% rT1. È stato segnalato che il DNA di EBV nello spazzolino nasofaringeo è sensibile al 96% e specifico al 96% per NPC prima del trattamento. È stato segnalato che il DNA di EBV nel tampone rinofaringeo scompare dopo la radioterapia e riappare con recidiva locale della mucosa con una sensibilità del 100% e una specificità del 98% in un piccolo caso di studio di 11 pazienti con recidive locali, i risultati dimostrano la sua potenziale individuazione di recidive locali che sono perso dal nostro follow-up convenzionale. Tuttavia necessita di ulteriori studi longitudinali prospettici per la verifica.
2. È stato scoperto che la metilazione della regione promotrice ricca di CG di molti geni oncosoppressori è un'anomalia genetica comune nell'NPC, ma non nel rinofaringe normale. Abbiamo dimostrato che il DNA del promotore metilato è rilevabile nel sangue periferico e nel tampone nasofaringeo dei pazienti NPC, ma raramente nei controlli normali. Utilizzando la combinazione di 3 geni metilati nel plasma, abbiamo trovato il 38% sensibile per il rilevamento di recidiva locale.

2. Obiettivo dello studio Valutare la sensibilità e la specificità della combinazione di EBV e geni marcatori di metilazione nei fluidi corporei sia del plasma che del pennello nasofaringeo insieme per lo screening di residui locali recuperabili precoci e NPC ricorrenti che non vengono rilevati dal protocollo clinico convenzionale di follow-up.

3. Ipotesi verificata:

1. I pazienti in remissione senza tumore residuo o ricorrente dopo il trattamento devono avere un livello di marcatori di fondo persistentemente negativo o molto basso sia nel pennello rinofaringeo che nel plasma durante il follow-up.
2. I pazienti con tumori locali o linfonodali residui o ricorrenti hanno un livello persistentemente elevato di marcatori oltre l'ottava settimana o una scomparsa/riduzione iniziale a un livello di fondo molto basso seguita da ricomparsa/aumento del livello dei marcatori nuovamente al follow-up. Il cambiamento temporale nella quantità di marcatori è importante per riflettere il carico tumorale di NPC residuo e ricorrente prima della presentazione clinica. Ipotizziamo che questi modelli saranno osservati in quei pazienti con NPC residuo/ricorrente nelle loro prime fasi salvabili prima della presentazione clinica.

4. Metodologia di studio:

1. Prima del trattamento

   1. La spazzola nasofaringea del tumore viene raccolta sotto guida endoscopica.
   2. Il campione di biopsia NPC viene quindi raccolto per la sezione istologica e anche congelato di fresco in azoto liquido e conservato in congelatore a -80°C per il successivo studio.
   3. Vengono raccolti anche 20 ml di sangue EDTA per lo studio.
   4. Il DNA dell'EBV ei marcatori di metilazione saranno sottoposti a screening nel tumore, nel pennello rinofaringeo e nel sangue utilizzando il metodo PCR quantitativo specifico per la metilazione. I protocolli di laboratorio sono stati riportati dalle nostre precedenti pubblicazioni su EBV DNA e studi di metilazione.

2. Rivalutazione post-trattamento dell'NPC residuo

   1. Sulla base dei nostri risultati pubblicati sullo studio del tempo di remissione dell'NPC residuo dopo il trattamento, abbiamo il nostro protocollo di follow-up di routine per eseguire la valutazione endoscopica e la biopsia casuale del rinofaringe all'ottava settimana post-trattamento per la valutazione dell'NPC residuo.
   2. Al momento dell'endoscopia all'ottava settimana, verranno raccolti pennello nasofaringeo e 20 ml di sangue per lo studio dei biomarcatori. L'EBV e specifici marcatori di metilazione del paziente selezionati dai risultati della biopsia tumorale del paziente verranno utilizzati per ogni singolo paziente per lo screening dell'NPC residuo.
   3. Di quei pazienti che hanno una biopsia positiva all'ottava settimana, la biopsia ripetuta verrà eseguita alla decima settimana. Se la biopsia è ancora positiva alla 10a settimana, verrà organizzato un trattamento di salvataggio di re-irradiazione o rinofaringectomia, a seconda dei casi. Se la biopsia ripetuta alla 10a settimana diventa negativa, il paziente verrà rivalutato dopo 4 settimane.
   4. Di quei pazienti con risultati negativi sia di biomarcatori che di biopsia all'ottava settimana, il paziente verrà seguito secondo un programma mensile.
   5. Di quei pazienti che hanno biomarcatori positivi ma biopsia negativa all'ottava settimana, verranno eseguite ulteriori biopsie rinofaringee alla decima settimana per assicurarsi che non manchi l'NPC residuo locale dalla precedente biopsia all'ottava settimana. Anche l'imaging radiologico verrà eseguito in questo momento. Verranno ripetuti anche lo spazzolino nasofaringeo e gli esami del sangue per tenere traccia del cambiamento temporale nel tempo. I pazienti con biopsia positiva alla 10a settimana riceveranno un trattamento di salvataggio appropriato di radioterapia o chirurgia e questi pazienti trarranno beneficio dallo screening molecolare. I pazienti che hanno una biopsia persistentemente negativa alla 10a settimana saranno seguiti secondo il programma e se non hanno recidiva al follow-up, questi pazienti hanno una sorveglianza molecolare falsa positiva.

3. Follow-up successivo per il rilevamento di NPC ricorrenti

   1. Un paziente con biopsia rinofaringea post-trattamento negativa all'8a/10a settimana sarà seguito ogni mese nel primo anno, ogni 2 mesi nel secondo anno e ogni 3 mesi nel terzo-quinto anno per un totale di 5 anni. Si prevede infatti che l'11% di essi svilupperà successivamente una recidiva locale. È il nostro protocollo di routine eseguire la rinoendoscopia per esaminare il rinofaringe durante ogni follow-up. Se non si osservano lesioni sospette nel rinofaringe, la biopsia non verrà eseguita e il paziente verrà riprogrammato per il follow-up.
   2. La biopsia rinofaringea verrà eseguita se si osserva una lesione sospetta durante l'endoscopia di follow-up. Se si dimostra che la biopsia è una recidiva, il paziente verrà gestito di conseguenza. Se la biopsia è negativa, il paziente verrà riprogrammato per un regolare follow-up.

   3. Lo spazzolino nasofaringeo e 20 ml di sangue verranno raccolti al follow-up ogni 2 mesi per il 1o e il 2o anno e ogni 3 mesi dal 3o al 5o anno per lo studio.

      L'EBV e gli specifici marcatori di metilazione del paziente selezionati dai risultati della biopsia tumorale del paziente saranno rivalutati per ogni singolo paziente per lo screening della recidiva locale.

   4. Se un paziente presenta reperti nasoendoscopici negativi e risultati di biomarcatori molecolari negativi sia nel plasma che nello spazzolino nasofaringeo, il paziente verrà regolarmente seguito come programmato.
   5. Se un paziente ha un riscontro nasoendoscopico negativo, ma si riscontra un risultato positivo del marcatore molecolare in almeno uno dei fluidi corporei o del marcatore, il paziente sarà rivalutato a fondo per le recidive perse durante il follow-up clinico di routine. Il paziente verrà sottoposto a imaging PET/TC/MRI e biopsie rinofaringee multiple casuali per valutare la possibile recidiva locale. Poiché un risultato plasmatico positivo può essere dovuto a metastasi linfonodali oa distanza, saranno esaminati altri siti di recidiva o nuovo tumore, se ritenuto necessario dal punto di vista clinico. Se la biopsia rinofaringea è positiva o viene trovata un'altra sede di recidiva, il paziente sarà gestito di conseguenza con un trattamento di salvataggio appropriato. Questi pazienti sono avvantaggiati dalla sorveglianza molecolare con vero risultato positivo. Se le ricerche di recidiva sono tutte negative, il paziente verrà riprogrammato per un follow-up regolare e se al paziente non viene dimostrata alcuna recidiva su un ulteriore follow-up, la sorveglianza molecolare è considerata falsa positiva.
4. Punto finale del follow-up Lo stato di follow-up post-trattamento a 5 anni sarà il nostro punto finale dello studio per ogni paziente.
5. Numero di pazienti reclutati e criteri di reclutamento:

Ci sono 130-150 nuovi pazienti NPC ogni anno al Queen Mary Hospital. Prevediamo di reclutare 350 pazienti per lo studio longitudinale a partire da gennaio 2006. I pazienti reclutati devono essere clinicamente idonei per la radioterapia curativa senza metastasi a distanza prima del trattamento. Nel 2008 si prevede di reclutare un totale di 350 pazienti. Di questi 350 pazienti, ci aspettiamo di vedere circa 35 pazienti che non presentano tumore locale residuo con valutazione di imaging e biopsia all'ottava settimana dopo la radioterapia con follow-up convenzionale, ma successivamente sviluppano una recidiva locale isolata entro 5 anni dal follow-up . Saremmo in grado di sapere quante di queste recidive locali trarranno beneficio dalla diagnosi precoce con sorveglianza molecolare, il loro stadio di recidiva e l'esito del trattamento. Di questi 350 pazienti, ci aspettiamo di avere circa 20 pazienti con recidiva linfonodale.