TNFSF11-hæmning og fertilitet: en prospektiv undersøgelse

Receptoraktivatoren af ​​NF-kB ligand (RANKL) system anses for vigtig for knoglehomeostase. RANKL findes i tre isoformer, og virkningerne af alle isoformer medieres gennem binding til en specifik receptor (receptoraktivator af NF-KB (RANK)). RANKL findes overvejende som et transmembranprotein, og signalering er derfor afhængig af celle-celle-interaktion til en nabocelle, der udtrykker RANK, som efterfølgende aktiverer NFKB og regulerer cellulær aktivering gennem regulering af cellecyklus, dvs. proliferation, differentiering og apoptose. RANKL-RANK interaktion modificeres af osteoprotegerin (OPG), som er et endogent udskilt protein, der binder RANKL og hæmmer dets signalering.

RANK/RANKL udløser et netværk af TRAF-medierede kinasekaskader, der fremmer osteoklastdifferentiering. RANKL udtrykkes på osteoblastceller og dets receptor, Rank, på præ-osteoklastiske celler. RANKL-ekspression stimuleres af en række faktorer, såsom IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α, vitamin D, Ca2+, parathyreoidea, glukokortikoider, prostaglandin E2 og immunsuppressive lægemidler, og er nedreguleret af TGF-α. RANK/RANKL-interaktionen inducerer differentiering og dannelse af multinukleerede modne osteoklaster, hvilket forårsager knogleresorption. Den tredje proteinagonist, osteoprotegerin (OPG), produceres også af osteoblaster og er kendt for at udøve en hæmmende effekt på den præ-osteoklastiske differentieringsproces. Ved at binde til RANKL også kendt som osteoprotegerin-bindende protein (OPGbp), hæmmer OPG RANK/RANKL-interaktionen og efterfølgende osteoklastogenese. OPG er således et meget effektivt anti-resorptivt middel. Den tjener også som lokkereceptor for den tumornekrosefaktor-relaterede apoptose-inducerende ligand (TRAIL) og øger celleoverlevelse ved at blokere de apoptotiske virkninger af denne ligand. Det faktum, at overekspression af OPG i mus resulterer i alvorlig osteopetrose, og at OPG-nul mus er osteoporotiske, vidner om OPG's fysiologiske betydning. Manglen på RANK eller RANKL inducerer osteopetrose hos mus.

Således er RANK/RANKL-systemet afgørende for aktivering af de knogleresorperende celler (osteoklaster). I skelettet udtrykker de knoglesyntetiserende celler (osteoblaster) RANKL, der signalerer til RANK på de umodne osteoklaster. Dette inducerer proliferation og aktivering af de celler, de begynder at proliferere og resorbere knogle. OPG produceres af somatiske celler i knoglen og denne produktion reguleres af kønshormoner, TGF-B og forskellige andre stoffer. I dag er Denosumab, som er et menneskefremstillet rekombinant antistof mod RANKL, brugt til at behandle osteoporose, da det hæmmer RANKL-signalering og forårsager mindre knogleresorption hos mennesker. RANKL-signalering har kun to andre kendte yderligere funktioner hos raske mennesker, hvor det er involveret i amning og immunrespons.

Efterforskerne har data, der viser, at RANKL, RANK og OPG udtrykkes på både RNA- og proteinniveau i den humane testikel. Sertoli-cellerne udtrykker RANKL, mens kønscellerne udtrykker RANK, og de peritubulære celler udtrykker OPG. Normalt aktiverer RANKL NFKB, og aktivering af denne vej i den mandlige gonaden ser ud til at regulere, om testikelcellerne prolifererer eller gennemgår apoptose i testiklen. Efterforskernes in vitro, ex vivo og in vivo data fra funktionelle modeller understøtter dette forslag, og denne vej ser derfor ud til at være en ny regulator af kønscelleproliferation.

Nedsat sædkvalitet er en væsentlig faktor for mandlig infertilitet. Sædkvaliteten er et indirekte mål for sædcellens evne til at udføre befrugtning. Evaluering af mandlig fertilitetspotentiale evalueres ved sædanalyse. Sædanalyse evaluerer visse egenskaber, og de mest almindelige variabler, der måles for at evaluere sædkvaliteten, er: sædtal, motilitet og morfologi.

Der er ingen behandling for mænd uden sædceller i ejakulatet eller endda et lægemiddel, der kan øge sædtallet hos infertile mænd. Derfor foreslår vi, at antistoffer mod RANKL, såsom Denosumab, kan bruges som en ny behandlingsmulighed for mandlig infertilitet, hvilket fremhæver en ny indikation for Denosumab-behandling.

Efterforskerne vil derfor teste, om hæmning af RANKL af Denosumab hos mennesker øger sædproduktionen og sædkvaliteten i denne lille prospektive interventionsundersøgelse.

Vi vil invitere 15 infertile mænd til detaljeret screening for at sikre inklusion og undersøgelsesafslutning af forventede 12 infertile mænd

BIOSTATISTISK ANALYSE

Alle analyserne vil blive udført i henhold til retningslinjerne for god klinisk praksis og de primære analyser i intention-to-treat-populationen, som omfattede alle patienter, der fik den første dosis medicin på dag 1. Vi vil analysere dataene på to måder. Den primære analyse vil fortsætte i overensstemmelse med baseline-værdier sammenlignet med udfaldsvariable efter intervention. Den sekundære analyse vil være baseret på at stratificere mændene efter undergruppeanalyser i forhold til de foruddefinerede primære og sekundære endepunkter.

Dataanalyse og kvalitet De primære endepunkter for denne protokol vil være ændringer i sædproduktionen evalueret ved totalt sædtal, sædkoncentration efterfulgt af antallet af progressive og bevægelige sædceller, morfologisk normale sædceller, sædmotilitet, progressiv motilitet og morfologi, som vil blive sammenlignet med parret t-test. Der findes flere sekundære endepunkter, men for den indledende undersøgelse vil fokus være på ændringer af følgende sekundære endepunkter: Sperm DFI, FSH, Inhibin B, serum OPG, RANKL, OPG, D-vitamin og calciumhomeostase. Forsøgspersoner, der afslutter deltagelsen efter besøgsdag 1, men før besøgsdag 180, vil blive inkluderet til dataanalyse indtil den sidste dag, de afgav sæd og blodprøve. Mænd, der kun afgiver sædprøver lejlighedsvis eller har manglende data ved ethvert besøg, vil stadig blive inkluderet i analysen. Mænd, der ikke opfylder kriterierne i protokollen, vil blive udelukket fra analysen. Mænd med feber over 38,5 grader Celsius vil ikke indgå i analyserne op til 3 måneder efter feberepisoden. Sædprøver opnået med en abstinensperiode på mindre end 24 timer eller med sædvolumen < 1,5 ml vil ikke indgå i analyserne. Disse værdier vil derefter blive videreført til analyser. Der anvendes et signifikansniveau på 5 %. Til de primære analyser beregnes Bonferronu-Holm p-værdi korrektion yderligere. Til den sekundære analyse anvendes ingen multiple testkorrektion. I stedet diskuteres resultaterne i lyset af de mange testsituationer.

1. Analyser mellem baseline versus forskellige tidspunkter Det første trin vil være at sammenligne ændringerne i primære resultater mellem baseline versus de forskellige tidspunkter. Spermatogenese tager normalt op til 70 dage hos mænd, og vi vil derfor bestemme forskellen til alle de individuelle tidspunkter og beregne gennemsnit for dag 80, 120 og 180 og sammenligne med baseline værdier for at bestemme effekten af ​​RANKL-hæmning på hele længden af ​​spermatogenese. Denne analyse vil vise, om der er en signifikant forskel mellem grupperne. For udfald målt gentagne gange vil dette indebære sammenligning af de estimerede hældninger eller ændringsrater for hvert udfald mellem grupperne. Blandede modeller giver mulighed for, at korrelationen mellem de gentagne observationer baseline-dag 1-dag 80-dag 180 fra hver mand kan inkorporeres passende i parameterestimering. For alle endepunkter målt ved baseline og dag 180, vil parrede t-tests blive brugt til at vurdere, om der er en signifikant forskel mellem grupperne og bestemme, om den gennemsnitlige ændring inden for hver gruppe adskiller sig signifikant fra nul. I begge tilfælde vil data blive transformeret efter behov for at opfylde modellens antagelser. Efterfølgende vil den samme analyse blive udført ved at bruge multipel regression med relevante konfoundere såsom sæson, BMI, rygning, varighed af abstinens, tid fra ejakulation til motilitetsvurdering, feber etc. for at se, om dette ændrer resultaterne For målte resultater, der ikke kan sammenlignet med t-test eller andre parametriske test på dag 1, dag 80 og dag 180, vil grupper blive sammenlignet ved hjælp af ikke-parametriske test, såsom Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært udfald vil dataene blive sammenlignet mellem de to grupper ved hjælp af betinget logistisk-regressionsanalyse med justering for relevante konfoundere (defineret som værende signifikant p<0,05 associeret).
2. Analyser efter stratificering i undergrupper Forsøgspersoner vil blive grupperet efter deres BMI, sædkvalitet, serum RANKL, OPG, calcium, PTH, osteocalcin eller andre knoglefaktorer vurderet på screeningsdagen. Undergruppeanalyserne vil i overensstemmelse med normal klinisk praksis og stratificering i passende grupper i henhold til den kliniske (BMI <25, 25-30, >30 osv.), tertiler eller højeste/laveste versus forblivende ved baseline. Analyser vil blive udført på hver timpeoint sammenlignet med baseline ud over gennemsnit/median af besøgsdag 80, 120, 180 med baseline og middel/median af alle besøg efter intervention.