Inibição de TNFSF11 e Fertilidade: um Estudo Prospectivo

O sistema receptor ativador do ligante NF-kB (RANKL) é considerado importante para a homeostase óssea. O RANKL existe em três isoformas e os efeitos de todas as isoformas são mediados pela ligação a um receptor específico (ativador do receptor de NF-KB (RANK)). O RANKL é predominantemente encontrado como uma proteína transmembranar e a sinalização é, portanto, dependente da interação célula-célula com uma célula vizinha que expressa o RANK que subsequentemente ativa o NFKB e regula a ativação celular por meio da regulação do ciclo celular, ou seja, proliferação, diferenciação e apoptose. A interação RANKL-RANK é modificada pela osteoprotegerina (OPG), que é uma proteína endógena secretada que se liga ao RANKL e inibe sua sinalização.

RANK/RANKL desencadeia uma rede de cascatas de quinase mediadas por TRAF que promovem a diferenciação de osteoclastos. RANKL é expresso em células osteoblásticas e seu receptor, Rank, em células pré-osteoclásticas. A expressão de RANKL é estimulada por vários fatores, como IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α, vitamina D, Ca2+, paratireoide, glicocorticóides, prostaglandina E2 e drogas imunossupressoras, e é regulada negativamente pelo TGF-α. A interação RANK/RANKL induz diferenciação e formação de osteoclastos maduros multinucleados, causando reabsorção óssea. O terceiro agonista de proteína, osteoprotegerina (OPG), também é produzido por osteoblastos e é conhecido por exercer um efeito inibitório no processo de diferenciação pré-osteoclástica. Ao se ligar ao RANKL, também conhecido como proteína de ligação à osteoprotegerina (OPGbp), o OPG inibe a interação RANK/RANKL e subsequente osteoclastogênese. OPG é, portanto, um agente anti-reabsorção muito eficiente. Ele também serve como um receptor chamariz para o ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL) e aumenta a sobrevivência celular bloqueando os efeitos apoptóticos desse ligante. O fato de que a superexpressão de OPG em camundongos resulta em osteopetrose grave e que camundongos nulos para OPG são osteoporóticos é testemunho da importância fisiológica da OPG. A falta de RANK ou RANKL induz osteopetrose em camundongos.

Assim, o sistema RANK/RANKL é vital para a ativação das células de reabsorção óssea (osteoclastos). No esqueleto, as células sintetizadoras de osso (osteoblastos) expressam RANKL que sinaliza para RANK nos osteoclastos imaturos. Isso induz a proliferação e ativação das células que começam a proliferar e reabsorver o osso. A OPG é produzida por células somáticas no osso e esta produção é regulada por hormônios sexuais, TGF-B e várias outras substâncias. Hoje, um anticorpo recombinante humano contra o RANKL, o Denosumab, é usado para tratar a osteoporose, pois inibe a sinalização do RANKL e causa menos reabsorção óssea em humanos. A sinalização RANKL tem apenas duas outras funções adicionais conhecidas em humanos saudáveis, onde está envolvida na lactação e na resposta imune.

Os investigadores têm dados que mostram que RANKL, RANK e OPG são expressos tanto no nível de RNA quanto de proteína no testículo humano. As células de Sertoli expressam RANKL, enquanto as células germinativas expressam RANK e as células peritubulares expressam OPG. Normalmente, o RANKL ativa o NFKB e a ativação dessa via na gônada masculina parece regular se as células testiculares proliferam ou sofrem apoptose no testículo. Os dados dos investigadores in vitro, ex vivo e in vivo de modelos funcionais suportam esta sugestão e esta via parece, portanto, ser um novo regulador da proliferação de células germinativas.

A diminuição da qualidade do sêmen é um dos principais fatores de infertilidade masculina. A qualidade do sêmen é uma medida indireta da capacidade do esperma de realizar a fertilização. A avaliação do potencial de fertilidade masculina é avaliada por análise de sêmen. A análise do sêmen avalia certas características e as variáveis ​​mais comuns medidas para avaliar a qualidade do esperma são: contagem, motilidade e morfologia do esperma.

Não há tratamento para homens sem espermatozóides no ejaculado ou mesmo um medicamento que possa aumentar o número de espermatozóides em homens inférteis. Portanto, sugerimos que anticorpos contra RANKL, como Denosumab, podem ser usados ​​como uma nova opção de tratamento para infertilidade masculina, que destaca uma nova indicação para o tratamento com Denosumabe.

Os investigadores irão, portanto, testar se a inibição de RANKL por Denosumab em humanos aumenta a produção de esperma e a qualidade do sêmen neste pequeno estudo prospectivo de intervenção.

Convidaremos 15 homens inférteis para triagem detalhada para garantir a inclusão e a conclusão do estudo de 12 homens inférteis previstos

ANÁLISE BIOSTATÍSTICA

Todas as análises serão realizadas de acordo com as diretrizes de Boas Práticas Clínicas e as análises primárias na população com intenção de tratar, que incluiu todos os pacientes que receberam a primeira dose do medicamento no dia 1. Analisaremos os dados de duas maneiras. A análise primária prosseguirá de acordo com os valores basais comparados com as variáveis ​​de resultados após a intervenção. A análise secundária será baseada na estratificação dos homens de acordo com as análises de subgrupo em relação aos endpoints primários e secundários predefinidos.

Análise e qualidade dos dados Os pontos finais primários para este protocolo serão mudanças na produção de espermatozoides avaliada pelo número total de espermatozóides, concentração de espermatozoides seguida pelo número de espermatozoides progressivos e móveis, espermatozoides morfologicamente normais, motilidade espermática, motilidade progressiva e morfologia que serão comparados por teste t pareado. Existem vários endpoints secundários, mas para a investigação inicial, o foco será nas alterações dos seguintes endpoints secundários: Esperma DFI, FSH, Inibina B, OPG sérico, RANKL, OPG, vitamina D e homeostase de cálcio. Os indivíduos que encerram a participação após o dia 1 da visita, mas antes do dia 180 da visita, serão incluídos para análise de dados até o último dia em que forneceram sêmen e amostra de sangue. Os homens que entregam apenas amostras de sêmen ocasionalmente ou têm dados ausentes em qualquer visita ainda serão incluídos na análise. Os homens que não atenderem aos critérios do protocolo serão excluídos da análise. Homens com febre acima de 38,5 graus Celsius não serão incluídos nas análises até 3 meses após o episódio febril. Amostras de sêmen obtidas com período de abstinência inferior a 24 horas ou com volume de sêmen < 1,5 ml não serão incluídas nas análises. Esses valores serão então levados para análise. É utilizado um nível de significância de 5%. Para as análises primárias, a correção do valor p de Bonferronu-Holm é calculada adicionalmente. Para a análise secundária, nenhuma correção de teste múltiplo é usada. Em vez disso, os resultados são discutidos tendo em vista as múltiplas situações de teste.

1. Análises entre a linha de base versus diferentes pontos de tempo O primeiro passo será comparar as mudanças nos resultados primários entre a linha de base e os diferentes pontos de tempo. A espermatogênese normalmente leva até 70 dias em homens e, portanto, determinaremos a diferença para todos os pontos de tempo individuais e calcularemos a média dos dias 80, 120 e 180 e compararemos com os valores basais para determinar o efeito da inibição de RANKL em toda a duração da espermatogênese. Esta análise mostrará se há uma diferença significativa entre os grupos. Para resultados medidos repetidamente, isso implicará comparar as inclinações estimadas, ou taxas de mudança, de cada resultado entre os grupos. Os modelos mistos permitem que a correlação entre as observações repetidas da linha de base-dia 1-dia 80-dia 180 de cada homem seja adequadamente incorporada na estimativa de parâmetros. Para todos os endpoints medidos na linha de base e no dia 180, testes t pareados serão usados ​​para avaliar se há uma diferença significativa entre os grupos e determinar se a alteração média dentro de cada grupo difere significativamente de zero. Em ambos os casos, os dados serão transformados conforme necessário para atender às suposições do modelo. Posteriormente, a mesma análise será realizada usando regressão múltipla com fatores de confusão relevantes, como estação do ano, IMC, tabagismo, duração da abstinência, tempo desde a ejaculação até a avaliação da motilidade, febre etc. em comparação com o teste t ou outros testes paramétricos no dia 1, dia 80 e dia 180, os grupos serão comparados usando testes não paramétricos, como o teste de Wilcoxon Mann-Whitney. Para o desfecho Binário, os dados serão comparados entre os dois grupos por meio de análise de regressão logística condicional com ajuste para fatores de confusão relevantes (definidos como sendo significativamente p<0,05 associados).
2. Análises após estratificação em subgrupos Os indivíduos serão agrupados de acordo com seu IMC, qualidade do sêmen, RANKL sérico, OPG, cálcio, PTH, osteocalcina ou outros fatores ósseos avaliados no dia da triagem. As análises de subgrupo serão feitas de acordo com a prática clínica normal e a estratificação em grupos apropriados de acordo com o clínico (IMC <25, 25-30, >30 etc.), tercis ou maior/menor versus restante na linha de base. As análises serão realizadas em cada ponto do tempo em comparação com a linha de base, além da média/mediana dos dias de visita 80, 120, 180 com a linha de base e média/mediana de todas as visitas após a intervenção.