TNFSF11-hämning och fertilitet: en prospektiv studie

Receptoraktivatorn för NF-kB ligand (RANKL) system anses viktig för benhomeostas. RANKL finns i tre isoformer och effekterna av alla isoformer medieras genom bindning till en specifik receptor (receptoraktivator av NF-KB (RANK)). RANKL finns övervägande som ett transmembranprotein och signalering är därför beroende av cell-cell-interaktion till en angränsande cell som uttrycker RANK som därefter aktiverar NFKB och reglerar cellulär aktivering genom reglering av cellcykeln, dvs proliferation, differentiering och apoptos. RANKL-RANK-interaktionen modifieras av osteoprotegerin (OPG), som är ett endogent utsöndrat protein som binder RANKL och hämmar dess signalering.

RANK/RANKL utlöser ett nätverk av TRAF-medierade kinaskaskader som främjar osteoklastdifferentiering. RANKL uttrycks på osteoblastceller och dess receptor, Rank, på pre-osteoklastiska celler. RANKL-uttryck stimuleras av ett antal faktorer, såsom IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α, vitamin D, Ca2+, bisköldkörtel, glukokortikoider, prostaglandin E2 och immunsuppressiva läkemedel, och är nedregleras av TGF-α. RANK/RANKL-interaktionen inducerar differentiering och bildning av mogna osteoklaster med flera kärnor, vilket orsakar benresorption. Den tredje proteinagonisten, osteoprotegerin (OPG), produceras också av osteoblaster och är känd för att utöva en hämmande effekt på den pre-osteoklastiska differentieringsprocessen. Genom att binda till RANKL, även känt som osteoprotegerinbindande protein (OPGbp), hämmar OPG RANK/RANKL-interaktionen och efterföljande osteoklastogenes. OPG är således ett mycket effektivt anti-resorptivt medel. Den fungerar också som en lockbetereceptor för den tumörnekrosfaktorrelaterade apoptosinducerande liganden (TRAIL) och ökar cellöverlevnaden genom att blockera de apoptotiska effekterna av denna ligand. Det faktum att överuttrycket av OPG i möss resulterar i svår osteopetros och att OPG-nullmöss är osteoporotiska är ett vittnesbörd om OPGs fysiologiska betydelse. Bristen på RANK eller RANKL inducerar osteopetros hos möss.

Således är RANK/RANKL-systemet avgörande för aktivering av de benresorperande cellerna (osteoklaster). I skelettet uttrycker de bensyntetiserande cellerna (osteoblasterna) RANKL som signalerar till RANK på de omogna osteoklasterna. Detta inducerar proliferation och aktivering av cellerna de börjar proliferera och resorpera ben. OPG produceras av somatiska celler i benet och denna produktion regleras av könshormoner, TGF-B och olika andra ämnen. Idag är Denosumab en rekombinant antikropp som är gjord av människan mot RANKL och används för att behandla osteoporos eftersom det hämmar RANKL-signalering och orsakar mindre benresorption hos människor. RANKL-signalering har bara två andra kända ytterligare funktioner hos friska människor där den är involverad i amning och immunsvar.

Utredarna har data som visar att RANKL, RANK och OPG uttrycks på både RNA- och proteinnivå i den mänskliga testikeln. Sertoli-cellerna uttrycker RANKL, medan könscellerna uttrycker RANK och de peritubulära cellerna uttrycker OPG. Normalt aktiverar RANKL NFKB och aktivering av denna väg i den manliga gonaden verkar reglera om testikelcellerna prolifererar eller genomgår apoptos i testiklarna. Utredarnas in vitro, ex vivo och in vivo data från funktionella modeller stödjer detta förslag och denna väg verkar därför vara en ny regulator av könscellsproliferation.

Försämrad spermakvalitet är en viktig faktor för manlig infertilitet. Spermakvalitet är ett indirekt mått på spermiernas förmåga att genomföra befruktning. Utvärdering av manlig fertilitetspotential utvärderas genom spermaanalys. Spermaanalys utvärderar vissa egenskaper och de vanligaste variablerna som mäts för att utvärdera spermiekvalitet är: spermieantal, motilitet och morfologi.

Det finns ingen behandling för män utan spermier i ejakulatet eller ens ett läkemedel som kan öka antalet spermier hos infertila män. Därför föreslår vi att antikroppar mot RANKL som Denosumab kan användas som ett nytt behandlingsalternativ för manlig infertilitet, vilket belyser en ny indikation för behandling med Denosumab.

Utredarna kommer därför att testa om hämning av RANKL av Denosumab hos människor ökar spermieproduktionen och spermakvaliteten i denna lilla prospektiva interventionsstudie.

Vi kommer att bjuda in 15 infertila män för detaljerad screening för att säkerställa inkludering och slutförande av studier av förväntade 12 infertila män

BIOSTATISTISK ANALYS

Alla analyser kommer att utföras enligt Good Clinical Practice-riktlinjer och de primära analyserna i intention-to-treat-populationen, som inkluderade alla patienter som fick den första dosen av medicinen dag 1. Vi kommer att analysera data på två sätt. Den primära analysen kommer att fortsätta enligt baslinjevärden jämfört med utfallsvariabler efter intervention. Den sekundära analysen kommer att baseras på att stratifiera männen enligt subgruppsanalyser i förhållande till de fördefinierade primära och sekundära effektmåtten.

Dataanalys och kvalitet De primära slutpunkterna för detta protokoll kommer att vara förändringar i spermieproduktionen utvärderad av totalt spermieantal, spermiekoncentration följt av antal progressiva och rörliga spermier, morfologiskt normala spermier, spermiemotilitet, progressiv motilitet och morfologi som kommer att jämföras med parat t-test. Flera sekundära endpoints finns men för den inledande undersökningen kommer fokus att ligga på förändringar av följande sekundära endpoints: Sperma DFI, FSH, Inhibin B, serum OPG, RANKL, OPG, vitamin D och kalciumhomeostas. Försökspersoner som avslutar deltagandet efter besöksdag 1 men före besöksdag 180 kommer att inkluderas för dataanalys fram till den sista dagen de lämnade sperma och blodprov. Män som endast levererar spermaprover ibland eller som saknar data vid något besök kommer fortfarande att inkluderas i analysen. Män som inte uppfyller kriterierna i protokollet kommer att exkluderas från analysen. Män med feber över 38,5 grader Celsius kommer inte att inkluderas i analyserna fram till 3 månader efter feberepisoden. Spermaprover som tagits med en abstinensperiod på mindre än 24 timmar eller med en spermavolym < 1,5 ml kommer inte att ingå i analyserna. Dessa värden kommer sedan att föras vidare för analyser. En signifikansnivå på 5 % används. För de primära analyserna beräknas Bonferronu-Holm p-värdeskorrektion dessutom. För den sekundära analysen används ingen multipla testkorrigering. Istället diskuteras resultaten med tanke på de många testsituationerna.

1. Analyser mellan baslinje kontra olika tidpunkter Det första steget kommer att vara att jämföra förändringarna i primära utfall mellan baslinjen kontra de olika tidpunkterna. Spermatogenes tar normalt upp till 70 dagar hos män och vi kommer därför att bestämma skillnaden till alla individuella tidpunkter och beräkna medelvärde för dag 80, 120 och 180 och jämföra med baslinjevärden för att bestämma effekten av RANKL-hämning på hela spermatogenesens längd. Denna analys kommer att visa om det finns en signifikant skillnad mellan grupperna. För utfall som mäts upprepade gånger kommer detta att innebära att man jämför de uppskattade lutningarna, eller förändringshastigheterna, för varje utfall mellan grupperna. Blandade modeller möjliggör att korrelationen mellan de upprepade observationerna baslinje-dag 1-dag 80-dag 180 från varje man på lämpligt sätt inkorporeras i parameteruppskattning. För alla effektmått uppmätta vid baslinjen och dag 180 kommer parade t-tester att användas för att bedöma att det finns en signifikant skillnad mellan grupperna och avgöra om medelförändringen inom varje grupp skiljer sig signifikant från noll. I båda fallen kommer data att omvandlas efter behov för att möta modellens antaganden. Efteråt kommer samma analys att genomföras genom att använda multipel regression med relevanta konfounders såsom säsong, BMI, rökning, abstinens varaktighet, tid från utlösning till motilitetsbedömning, feber etc. för att se om detta förändrar resultaten För uppmätta resultat som inte kan jämfört med t-test eller andra parametriska test på dag 1, dag 80 och dag 180, kommer grupper att jämföras med hjälp av icke-parametriska tester såsom Wilcoxon Mann-Whitney test. För binärt utfall kommer data att jämföras mellan de två grupperna med hjälp av villkorad logistisk regressionsanalys med justering för relevanta konfounders (definierad som signifikant p<0,05 associerad).
2. Analyser efter stratifiering i undergrupper Försökspersonerna kommer att grupperas efter deras BMI, spermakvalitet, serum RANKL, OPG, kalcium, PTH, osteokalcin eller andra benfaktorer som utvärderas på dagen för screening. Undergruppsanalyserna kommer i enlighet med normal klinisk praxis och stratifiering i lämpliga grupper enligt kliniska (BMI <25, 25-30, >30 etc.), tertiler eller högsta/lägsta kontra kvarstående vid baslinjen. Analyser kommer att utföras på varje timpeoint jämfört med baseline utöver medelvärde/median för besöksdag 80, 120, 180 med baslinje och medelvärde/median för alla besök efter intervention.