Inibizione e fertilità del TNFSF11: uno studio prospettico

L'attivatore del recettore del sistema ligando NF-kB (RANKL) è considerato importante per l'omeostasi ossea. RANKL esiste in tre isoforme e gli effetti di tutte le isoforme sono mediati dal legame con un recettore specifico (attivatore del recettore di NF-KB (RANK)). RANKL si trova prevalentemente come proteina transmembrana e la segnalazione dipende quindi dall'interazione cellula-cellula verso una cellula vicina che esprime RANK che successivamente attiva NFKB e regola l'attivazione cellulare attraverso la regolazione del ciclo cellulare, ovvero proliferazione, differenziazione e apoptosi. L'interazione RANKL-RANK è modificata dall'osteoprotegerina (OPG), che è una proteina secreta endogena che lega RANKL e ne inibisce la segnalazione.

RANK/RANKL innesca una rete di cascate di chinasi mediate da TRAF che promuovono la differenziazione degli osteoclasti. RANKL è espresso sulle cellule osteoblastiche e il suo recettore, Rank, sulle cellule pre-osteoclastiche. L'espressione di RANKL è stimolata da una serie di fattori, come IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α, vitamina D, Ca2+, paratiroidi, glucocorticoidi, prostaglandina E2 e farmaci immunosoppressori, ed è down-regolato dal TGF-α. L'interazione RANK/RANKL induce la differenziazione e la formazione di osteoclasti maturi multinucleati, causando il riassorbimento osseo. Anche il terzo agonista proteico, l'osteoprotegerina (OPG), è prodotto dagli osteoblasti ed è noto per esercitare un effetto inibitorio sul processo di differenziazione pre-osteoclastico. Legandosi al RANKL noto anche come proteina legante l'osteoprotegerina (OPGbp), l'OPG inibisce l'interazione RANK/RANKL e la successiva osteoclastogenesi. L'OPG è quindi un agente anti-riassorbimento molto efficiente. Funge anche da recettore esca per il ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale (TRAIL) e aumenta la sopravvivenza cellulare bloccando gli effetti apoptotici di questo ligando. Il fatto che la sovraespressione di OPG nei topi provochi una grave osteopetrosi e che i topi privi di OPG siano osteoporotici testimonia l'importanza fisiologica dell'OPG. La mancanza di RANK o RANKL induce l'osteopetrosi nei topi.

Pertanto, il sistema RANK/RANKL è vitale per l'attivazione delle cellule di riassorbimento osseo (osteoclasti). Nello scheletro le cellule che sintetizzano l'osso (osteoblasti) esprimono RANKL che segnala a RANK sugli osteoclasti immaturi. Ciò induce la proliferazione e l'attivazione delle cellule che iniziano a proliferare e riassorbire l'osso. L'OPG è prodotto dalle cellule somatiche dell'osso e questa produzione è regolata dagli ormoni sessuali, dal TGF-B e da varie altre sostanze. Oggi un anticorpo ricombinante prodotto dall'uomo contro RANKL, Denosumab è usato per trattare l'osteoporosi poiché inibisce la segnalazione di RANKL e causa un minore riassorbimento osseo negli esseri umani. La segnalazione RANKL ha solo altre due funzioni aggiuntive note negli esseri umani sani dove è coinvolta nell'allattamento e nella risposta immunitaria.

I ricercatori hanno dati che mostrano che RANKL, RANK e OPG sono espressi sia a livello di RNA che di proteine ​​nel testicolo umano. Le cellule del Sertoli esprimono RANKL, mentre le cellule germinali esprimono RANK e le cellule peritubulari esprimono OPG. Normalmente, RANKL attiva NFKB e l'attivazione di questo percorso nella gonade maschile sembra regolare se le cellule testicolari proliferano o subiscono l'apoptosi nel testicolo. I dati in vitro, ex vivo e in vivo dei ricercatori da modelli funzionali supportano questo suggerimento e questo percorso sembra quindi essere un nuovo regolatore della proliferazione delle cellule germinali.

La diminuzione della qualità dello sperma è un fattore importante dell'infertilità maschile. La qualità del seme è una misura indiretta della capacità dello sperma di realizzare la fecondazione. La valutazione del potenziale di fertilità maschile viene valutata mediante analisi del seme. L'analisi del seme valuta alcune caratteristiche e le variabili più comuni misurate per valutare la qualità dello sperma sono: numero di spermatozoi, motilità e morfologia.

Non esiste alcun trattamento per gli uomini senza spermatozoi nell'eiaculato o persino un farmaco che possa aumentare il numero di spermatozoi negli uomini infertili. Pertanto, suggeriamo che gli anticorpi contro RANKL come Denosumab possano essere usati come una nuova opzione di trattamento per l'infertilità maschile, che evidenzia una nuova indicazione per il trattamento con Denosumab.

I ricercatori verificheranno quindi se l'inibizione di RANKL da parte di Denosumab negli esseri umani aumenta la produzione di sperma e la qualità dello sperma in questo piccolo studio di intervento prospettico.

Inviteremo 15 uomini infertili per uno screening dettagliato per garantire l'inclusione e il completamento dello studio di 12 uomini infertili previsti

ANALISI BIOSTATISTICA

Tutte le analisi saranno eseguite secondo le linee guida di buona pratica clinica e le analisi primarie nella popolazione intent-to-treat, che includeva tutti i pazienti che hanno ricevuto la prima dose di medicinale il giorno 1. Analizzeremo i dati in due modi. L'analisi primaria procederà in base ai valori di base confrontati con le variabili dei risultati dopo l'intervento. L'analisi secondaria si baserà sulla stratificazione degli uomini secondo analisi di sottogruppi in relazione agli endpoint primari e secondari predefiniti.

Analisi e qualità dei dati Gli endpoint primari per questo protocollo saranno i cambiamenti nella produzione di spermatozoi valutati dal numero totale di spermatozoi, concentrazione di spermatozoi seguita dal numero di spermatozoi progressivi e mobili, spermatozoi morfologicamente normali, motilità degli spermatozoi, motilità progressiva e morfologia che saranno confrontati da test t accoppiato. Esistono molteplici endpoint secondari, ma per l'indagine iniziale ci si concentrerà sui cambiamenti dei seguenti endpoint secondari: Sperm DFI, FSH, Inhibin B, OPG sierico, RANKL, OPG, vitamina D e omeostasi del calcio. I soggetti che terminano la partecipazione dopo il giorno 1 della visita ma prima del giorno 180 della visita saranno inclusi per l'analisi dei dati fino all'ultimo giorno in cui hanno fornito seme e campione di sangue. Gli uomini che consegnano campioni di sperma solo occasionalmente o hanno dati mancanti a qualsiasi visita saranno comunque inclusi nell'analisi. Gli uomini che non soddisfano i criteri del protocollo saranno esclusi dall'analisi. Gli uomini con febbre superiore a 38,5 gradi Celsius non saranno inclusi nelle analisi fino a 3 mesi dopo l'episodio febbrile. I campioni di seme ottenuti con un periodo di astinenza inferiore a 24 ore o con un volume di seme < 1,5 ml non saranno inclusi nelle analisi. Tali valori verranno quindi riportati per le analisi. Viene utilizzato un livello di significatività del 5%. Per le analisi primarie viene calcolata in aggiunta la correzione del valore p di Bonferronu-Holm. Per l'analisi secondaria non viene utilizzata alcuna correzione del test multiplo. Invece i risultati sono discussi in considerazione delle molteplici situazioni di test.

1. Analisi tra la linea di base rispetto a diversi punti temporali Il primo passo sarà confrontare i cambiamenti nei risultati primari tra la linea di base rispetto ai diversi punti temporali. La spermatogenesi richiede normalmente fino a 70 giorni negli uomini e quindi determineremo la differenza rispetto a tutti i singoli punti temporali e calcoleremo la media per i giorni 80, 120 e 180 e la confronteremo con i valori basali per determinare l'effetto dell'inibizione di RANKL sull'intera durata della spermatogenesi. Questa analisi mostrerà se c'è una differenza significativa tra i gruppi. Per i risultati misurati ripetutamente, ciò comporterà il confronto delle pendenze stimate, o tassi di variazione, di ciascun risultato tra i gruppi. I modelli misti consentono di incorporare opportunamente nella stima dei parametri la correlazione tra le osservazioni ripetute al basale giorno 1 giorno 80 giorni 180 di ciascun uomo. Per tutti gli endpoint misurati al basale e al giorno 180, verranno utilizzati t-test accoppiati per valutare l'esistenza di una differenza significativa tra i gruppi e determinare se la variazione media all'interno di ciascun gruppo differisce in modo significativo da zero. In entrambi i casi, i dati verranno trasformati secondo necessità per soddisfare le ipotesi del modello. Successivamente, la stessa analisi sarà condotta utilizzando la regressione multipla con fattori confondenti rilevanti come stagione, indice di massa corporea, fumo, durata dell'astinenza, tempo dall'eiaculazione alla valutazione della motilità, febbre ecc. per vedere se questo cambia i risultati Per i risultati misurati che non possono essere rispetto al test t o ad altri test parametrici al giorno 1, giorno 80 e giorno 180, i gruppi saranno confrontati utilizzando test non parametrici come il test di Wilcoxon Mann-Whitney. Per l'esito binario i dati saranno confrontati tra i due gruppi mediante analisi di regressione logistica condizionale con aggiustamento per fattori confondenti rilevanti (definiti come significativamente p<0.05 associati).
2. Analisi dopo la stratificazione in sottogruppi I soggetti saranno raggruppati in base al loro BMI, qualità del seme, RANKL sierico, OPG, calcio, PTH, osteocalcina o altri fattori ossei valutati il ​​giorno dello screening. Le analisi dei sottogruppi saranno conformi alla normale pratica clinica e alla stratificazione in gruppi appropriati in base al clinico (BMI <25, 25-30, >30 ecc.), terzili o massimo/minimo rispetto al valore basale. Le analisi verranno eseguite su ciascun timepoint rispetto al basale oltre alla media/mediana dei giorni di visita 80, 120, 180 con basale e media/mediana di tutte le visite dopo l'intervento.