TNFSF11-hemming og fruktbarhet: en prospektiv studie

Reseptoraktivatoren til NF-kB ligand (RANKL) system anses som viktig for benhomeostase. RANKL eksisterer i tre isoformer og effekten av alle isoformer medieres gjennom binding til en spesifikk reseptor (reseptoraktivator av NF-KB (RANK)). RANKL finnes hovedsakelig som et transmembranprotein og signalering er derfor avhengig av celle-celle-interaksjon til en nabocelle som uttrykker RANK som deretter aktiverer NFKB og regulerer cellulær aktivering gjennom regulering av cellesyklus, dvs. proliferasjon, differensiering og apoptose. RANKL-RANK interaksjon modifiseres av osteoprotegerin (OPG), som er et endogent utskilt protein som binder RANKL og hemmer dets signalering.

RANK/RANKL utløser et nettverk av TRAF-mediert kinasekaskader som fremmer osteoklastdifferensiering. RANKL uttrykkes på osteoblastceller og dens reseptor, Rank, på pre-osteoklastiske celler. RANKL-ekspresjon stimuleres av en rekke faktorer, som IL-1, IL-6, IL-11, IL-17, TNF-α, vitamin D, Ca2+, parathyroid, glukokortikoider, prostaglandin E2 og immundempende legemidler, og er nedregulert av TGF-α. RANK/RANKL-interaksjonen induserer differensiering og dannelse av multinukleerte modne osteoklaster, noe som forårsaker benresorpsjon. Den tredje proteinagonisten, osteoprotegerin (OPG), produseres også av osteoblaster og er kjent for å ha en hemmende effekt på den pre-osteoklastiske differensieringsprosessen. Ved å binde seg til RANKL også kjent som osteoprotegerinbindende protein (OPGbp), hemmer OPG RANK/RANKL-interaksjonen og påfølgende osteoklastogenese. OPG er dermed et meget effektivt anti-resorptivt middel. Den fungerer også som en lokkereseptor for den tumornekrosefaktorrelaterte apoptoseinduserende liganden (TRAIL) og øker celleoverlevelsen ved å blokkere de apoptotiske effektene av denne liganden. Det faktum at overekspresjon av OPG i mus resulterer i alvorlig osteopetrose og at OPG-nullmus er osteoporotiske er vitnesbyrd om den fysiologiske betydningen av OPG. Mangelen på RANK eller RANKL induserer osteopetrose hos mus.

Dermed er RANK/RANKL-systemet avgjørende for aktivering av de benresorperende cellene (osteoklaster). I skjelettet uttrykker de bensyntetiserende cellene (osteoblaster) RANKL som signaliserer til RANK på de umodne osteoklastene. Dette induserer spredning og aktivering av cellene de begynner å proliferere og resorbere bein. OPG produseres av somatiske celler i beinet og denne produksjonen reguleres av kjønnshormoner, TGF-B og diverse andre stoffer. I dag er Denosumab et rekombinant antistoff mot RANKL, og brukes til å behandle osteoporose da det hemmer RANKL-signalering og forårsaker mindre benresorpsjon hos mennesker. RANKL-signalering har bare to andre kjente tilleggsfunksjoner hos friske mennesker der den er involvert i amming og immunrespons.

Etterforskerne har data som viser at RANKL, RANK og OPG er uttrykt på både RNA- og proteinnivå i den menneskelige testis. Sertoli-cellene uttrykker RANKL, mens kjønnscellene uttrykker RANK og de peritubulære cellene uttrykker OPG. Normalt aktiverer RANKL NFKB og aktivering av denne banen i den mannlige gonaden ser ut til å regulere om testikkelcellene prolifererer eller gjennomgår apoptose i testikkelen. Etterforskernes in vitro-, ex vivo- og in vivo-data fra funksjonelle modeller støtter dette forslaget, og denne veien ser derfor ut til å være en ny regulator for kjønnscelleproliferasjon.

Redusert sædkvalitet er en viktig faktor for mannlig infertilitet. Sædkvalitet er et indirekte mål på sædcellens evne til å utføre befruktning. Evaluering av mannlig fruktbarhetspotensial evalueres ved sædanalyse. Sædanalyse evaluerer visse egenskaper, og de vanligste variablene som måles for å evaluere sædkvaliteten er: antall sædceller, motilitet og morfologi.

Det finnes ingen behandling for menn uten sædceller i ejakulatet eller til og med et medikament som kan øke sædtallet hos infertile menn. Derfor foreslår vi at antistoffer mot RANKL som Denosumab kan brukes som et nytt behandlingsalternativ for mannlig infertilitet, som fremhever en ny indikasjon for Denosumab-behandling.

Etterforskerne vil derfor teste om hemming av RANKL av Denosumab hos mennesker øker sædproduksjonen og sædkvaliteten i denne lille prospektive intervensjonsstudien.

Vi vil invitere 15 infertile menn til detaljert screening for å sikre inkludering og studiefullføring av antatte 12 infertile menn

BIOSTATISTISK ANALYSE

Alle analysene vil bli utført i henhold til retningslinjer for god klinisk praksis og primæranalysene i intention-to-treat-populasjonen, som inkluderte alle pasienter som fikk første dose medisin på dag 1. Vi vil analysere dataene på to måter. Primæranalysen vil fortsette i henhold til baseline-verdier sammenlignet med utfallsvariabler etter intervensjon. Sekundæranalysen vil være basert på å stratifisere mennene etter undergruppeanalyser i forhold til de forhåndsdefinerte primære og sekundære endepunktene.

Dataanalyse og kvalitet De primære endepunktene for denne protokollen vil være endringer i sædproduksjon evaluert ved totalt antall sædceller, sædkonsentrasjon etterfulgt av antall progressive og bevegelige sædceller, morfologisk normale sædceller, sædmotilitet, progressiv motilitet og morfologi som vil bli sammenlignet med paret t-test. Det finnes flere sekundære endepunkter, men for den innledende undersøkelsen vil fokus være på endringer av følgende sekundære endepunkter: Sperm DFI, FSH, Inhibin B, serum OPG, RANKL, OPG, vitamin D og kalsiumhomeostase. Forsøkspersoner som avslutter deltakelsen etter besøksdag 1 men før besøksdag 180 vil bli inkludert for dataanalyse frem til siste dag de ga sæd og blodprøve. Menn som kun leverer sædprøver av og til eller som mangler data ved ethvert besøk vil fortsatt inkluderes i analysen. Menn som ikke oppfyller kriteriene i protokollen vil bli ekskludert fra analysen. Menn med feber over 38,5 grader Celsius vil ikke inkluderes i analysene inntil 3 måneder etter feberepisoden. Sædprøver tatt med en abstinensperiode på mindre enn 24 timer eller med sædvolum < 1,5 ml vil ikke inngå i analysene. Disse verdiene vil deretter bli videreført for analyser. Det benyttes et signifikansnivå på 5 %. For primæranalysene beregnes Bonferronu-Holm p-verdikorreksjon i tillegg. For den sekundære analysen brukes ingen multiple testkorreksjon. I stedet diskuteres resultatene i lys av de mange testsituasjonene.

1. Analyser mellom baseline versus forskjellige tidspunkter Det første trinnet vil være å sammenligne endringene i primære utfall mellom baseline versus de forskjellige tidspunktene. Spermatogenese tar normalt opptil 70 dager hos menn og vi vil derfor bestemme forskjellen til alle de individuelle tidspunktene og beregne gjennomsnitt for dag 80, 120 og 180 og sammenligne med baseline-verdier for å bestemme effekten av RANKL-hemming på hele lengden av spermatogenese. Denne analysen vil vise om det er en signifikant forskjell mellom gruppene. For utfall målt gjentatte ganger, vil dette innebære å sammenligne de estimerte stigningene, eller endringsratene, for hvert utfall mellom gruppene. Blandede modeller åpner for at korrelasjonen mellom de gjentatte observasjonene baseline-dag 1-dag 80-dag 180 fra hver mann kan være passende inkorporert i parameterestimering. For alle endepunktene målt ved baseline og dag 180, vil parede t-tester bli brukt for å vurdere det er en signifikant forskjell mellom gruppene og avgjøre om gjennomsnittsendringen innen hver gruppe skiller seg signifikant fra null. I begge tilfeller vil data transformeres etter behov for å møte modellens forutsetninger. Etterpå vil den samme analysen bli utført ved å bruke multippel regresjon med relevante konfoundere som sesong, BMI, røyking, varighet av abstinens, tid fra utløsning til motilitetsvurdering, feber etc. for å se om dette endrer resultatene For målte resultater som ikke kan sammenlignet med t-test eller andre parametriske tester på dag 1, dag 80 og dag 180, vil grupper sammenlignes ved bruk av ikke-parametriske tester som Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært utfall vil dataene bli sammenlignet mellom de to gruppene ved hjelp av betinget logistisk-regresjonsanalyse med justering for relevante konfoundere (definert som signifikant p<0,05 assosiert).
2. Analyser etter stratifisering i undergrupper. Forsøkspersonene vil bli gruppert i henhold til deres BMI, sædkvalitet, serum RANKL, OPG, kalsium, PTH, osteokalsin eller andre benfaktorer evaluert på screeningsdagen. Undergruppeanalysene vil i henhold til normal klinisk praksis og stratifisering i passende grupper i henhold til klinisk (BMI <25, 25-30, >30 etc.), tertil eller høyest/lavest versus gjenværende ved baseline. Analyser vil bli utført på hver timepunkt sammenlignet med baseline i tillegg til gjennomsnitt/median av besøksdag 80, 120, 180 med baseline og gjennomsnitt/median av alle besøk etter intervensjon.