K-vitamiinilisätutkimus terveillä vapaaehtoisilla (tavoite 2B)

Tutkijat tutkivat K-vitamiinilisän vaikutusta kahteen maksan K-vitamiinipitoisuuden biomarkkeriin ryhmissä, joilla on määritelty CYP4F2*3-genotyyppi. Erityisesti tutkijat testaavat yhteyttä uusien biomarkkereihimme pitkäaikaisten (plasmatekijä II -proteoformien) ja lyhytaikaisten (virtsan K-hapon kataboliitit) maksan K-vitamiinipitoisuuksien ja CYP4F2*3:n välillä 10 päivän vitamiinijakson jälkeen. K-lisä terveillä vapaaehtoisilla.

Tutkijat rekrytoivat terveitä vapaaehtoisia miehiä ja naisia ​​UWMC:ssä julkaistujen ilmoitusten avulla. Käytetään kaksivaiheista valintaprosessia. Aiheet valitsevat itse vastaamalla lehtisiin ja ottavat yhteyttä tutkimuskoordinaattoriin. Tutkimuskoordinaattori tarkistaa heidän kelpoisuuden puhelimitse ja varaa ajan ensimmäiselle opintovierailulle, mikäli se on kelvollinen. Ensimmäistä vaihetta varten tutkimuskoordinaattori kerää DNA:ta bukkaalista vanupuikkoa ~ 200 soveltuvalta hakijalta; DNA testataan CYP4F2*3-varianttialleelin puuttumisen tai esiintymisen varalta. PI ja tutkimuskoordinaattori tarkastelevat genotyyppien tulokset ja valitsevat sitten 14 yksilöä, joilla on joko homotsygoottinen CYP4F2*3 genotyyppi tai heterotsygoottinen CYP4F2*1/*3 genotyyppi, ja demografisesti yhteensopivan 14 henkilön ryhmän, jolla on homotsygoottinen CYP4F2*1 genotyyppi. diagnostinen lokus tutkimuksen täydennysvaihetta varten. Tutkimuskoordinaattori ottaa sitten yhteyttä näihin aiheisiin puhelimitse vaiheen II osallistumista varten.

Toimenpiteet - Vaihe I, Bukkaalivanupuikkojen kerääminen DNA:n eristämiseksi.

Demografinen kyselylomake: Itseraportoitu perintö, ikä ja sukupuoli kerätään lyhyen demografisen kyselyn avulla.

Bukkaalinen vanupuikko: Keräämme poskisoluja vanupuikolla ja eristämme DNA:n ja testaamme CYP4F2*1- ja CYP4F2*3-alleelit.

Genotyypitys: CYP4F2-genotyyppi määritetään validoidulla TaqMan-määrityksellä (ABI/ThermoFisher Scientific), jossa käytetään kaupallisesti saatavia DNA-hybridisaatiokoettimia CYP4F2*3-alleelin puuttumisen tai läsnäolon testaamiseksi. Koehenkilöt, joilla on joko homotsygoottinen CYP4F2*3-genotyyppi tai heterotsygoottinen CYP4F2*1/*3-genotyyppi ja CYP4F2*3-alleelit, ovat kelvollisia vaiheeseen II.

Toimenpiteet - Vaihe II, K-vitamiinilisä.

K-vitamiinilisä: CYP4F2-genotyyppiin perustuvaan lisätutkimukseen valituille tutkijoille annetaan 1 mg/vrk fyllokinonia (Vitacost; Natures Life K-1 Phylloquinone) 10 peräkkäisenä päivänä. Jokainen annos otetaan aamulla (noin klo 8.00) ja puoli pinttiä 2 % maitoa imeytymisen helpottamiseksi.

Näytteenotto: Täydennystutkimusta varten otetaan laskimoverinäyte (10 ml EDTA-putki) ja pistevirtsanäyte yön yli paaston jälkeen d1-d5 ja d8 ja 10 K-vitamiinilisän jälkeen 10 päivän ajan. Plasma eristetään ja molemmat näytteet säilytetään -70 °C:ssa analyysiin asti. Hedelmällisessä iässä oleville naisille tehdään virtsaraskaustesti d1, ja jos se on positiivinen, heidät poistetaan tutkimuksesta ja kaikki näytteet ja tiedot tuhotaan.

Plasmatekijä II:n proteoformien mittaus: Tekijä II:n 11 yksittäisen proteomuodon plasmapitoisuus mitataan LC-MS/MS:llä. Näitä tietoja käytetään kolmen pitkän aikavälin K-vitamiinin tilan laskemiseen: unFII, ucFII:iFII ja inFII:aFII. Nämä edustavat erilaisia ​​matemaattisia mittareita tekijä II:n alikarboksylaatioasteelle. Plasman K1-vitamiinin, PIVKA II:n ja ucOC:n prospektiivisia analyysejä ei suunnitella, mutta se pidetään varauksessa, jos näitä tietoja tarvitaan.

Virtsan K-hapon I ja II mittaus: K-hapon I ja II sekä kreatiniinin (Cr) kvantifiointi pistevirtsanäytteistä suoritetaan käyttämällä validoitua LC-MS/MS-määritystä, jonka tutkijat ovat äskettäin kehittäneet. Kokonais- ja yksittäinen virtsan K-happo/Cr-suhde lasketaan.

Tilastollinen analyysisuunnitelma: Tutkijat tekevät parittoman t-testin vertaillakseen keskimääräistä vastetta K-vitamiinilisään kahdessa CYP4F2-genotyyppiryhmässä. Vaste määritellään alueeksi K-vitamiinin tilaarvon x aikakäyrän alapuolella, perusviivalla korjattuna 10 päivän interventiojaksolla. Toissijainen mittari on absoluuttinen huippumuutos K-vitamiinin tilasuhteessa. Sekä lyhyet (virtsan K-Acid/Cr-suhde) että pitkän aikavälin (ucFII:iFII ja inFII:aFII) biomarkkerit testataan erikseen. Pilottitietojen perusteella näytteen koko 14 kussakin genotyyppiryhmässä antaa vähintään 80 %:n tehon havaita merkittävä vaikutus merkitsevyystasolla 0,05, kun täydennysvasteessa on kaksinkertainen ero.