Vitamin-K-Ergänzungsstudie bei gesunden Freiwilligen (Ziel 2B)

Die Forscher werden die Wirkung einer Vitamin-K-Ergänzung auf zwei Biomarker der hepatischen Vitamin-K-Konzentration in Gruppen mit definiertem CYP4F2*3-Genotyp untersuchen. Insbesondere werden die Forscher einen Zusammenhang zwischen unseren neuartigen Biomarkern der langfristigen (Plasmafaktor-II-Proteoformen) und kurzfristigen (Urin-K-Säure-Kataboliten) Leber-Vitamin-K-Konzentration und CYP4F2*3 nach einer 10-tägigen Einnahme von Vitamin testen K-Supplementierung bei gesunden Probanden.

Die Ermittler rekrutieren durch aufgehängte Anzeigen bei UWMC männliche und weibliche gesunde Freiwillige. Es findet ein zweistufiges Auswahlverfahren statt. Die Probanden wählen sich selbst aus, indem sie auf Flyer antworten, und wenden sich an den Forschungskoordinator. Der Forschungskoordinator prüft sie telefonisch auf Eignung und vereinbart bei Eignung einen Termin für den ersten Studienbesuch. In der ersten Phase wird der Forschungskoordinator einen bukkalen DNA-Abstrich von etwa 200 geeigneten Kandidaten entnehmen; die DNA wird auf das Fehlen oder Vorhandensein des CYP4F2*3-Variantenallels getestet. Der PI- und Forschungskoordinator überprüft die Genotypisierungsergebnisse und wählt dann 14 Personen mit entweder einem homozygoten CYP4F2*3-Genotyp oder einem heterozygoten CYP4F2*1/*3-Genotyp und eine demographisch passende Gruppe von 14 Personen mit einem homozygoten CYP4F2*1-Genotyp aus diagnostischer Ort für die Ergänzungsphase der Studie. Der Studienkoordinator wird diese Probanden dann telefonisch für die Teilnahme an Phase II kontaktieren.

Verfahren – Phase I, Wangenabstrichentnahme zur DNA-Isolierung.

Demografischer Fragebogen: Selbstberichtete Herkunft, Alter und Geschlecht werden durch einen kurzen demografischen Fragebogen erfasst.

Wangenabstrich: Wir werden Wangenzellen mit einem Wattestäbchen sammeln und DNA isolieren und auf die CYP4F2*1- und CYP4F2*3-Allele testen.

Genotypisierung: Der CYP4F2-Genotyp wird durch einen validierten TaqMan-Assay (ABI/ThermoFisher Scientific) bestimmt, wobei im Handel erhältliche DNA-Hybridisierungssonden verwendet werden, um das Fehlen oder Vorhandensein des CYP4F2*3-Allels zu testen. Patienten, die entweder einen homozygoten CYP4F2*3-Genotyp oder einen heterozygoten CYP4F2*1/*3-Genotyp und CYP4F2*3-Allele aufweisen, sind für Phase II geeignet.

Verfahren – Phase II, Vitamin-K-Ergänzung.

Vitamin-K-Ergänzung: Forschungsteilnehmer, die für die Ergänzungsstudie basierend auf dem CYP4F2-Genotyp ausgewählt wurden, erhalten 1 mg/Tag Phyllochinon (Vitacost; Natures Life K-1 Phyllochinon) an 10 aufeinanderfolgenden Tagen. Jede Dosis wird morgens (~ 8 Uhr morgens) mit einem halben Liter 2%iger Milch eingenommen, um die Absorption zu erleichtern.

Probenentnahme: Für die Supplementierungsstudie werden eine venöse Blutprobe (10-ml-EDTA-Röhrchen) und eine Spot-Urinprobe nach einer nächtlichen Fastenzeit von d1 bis d5 und an d8 und d10 der Vitamin-K-Ergänzung für 10 Tage entnommen. Das Plasma wird isoliert und beide Proben werden bis zur Analyse bei -70 °C gelagert. Frauen im gebärfähigen Alter werden einem Urin-Schwangerschaftstest von d1 unterzogen und bei positivem Ergebnis aus der Studie genommen, und alle Proben und Daten werden vernichtet.

Messung von Faktor-II-Proteoformen im Plasma: Die Plasmakonzentration der 11 einzelnen Proteoformen von Faktor II wird mittels LC-MS/MS gemessen. Diese Daten werden verwendet, um drei Metriken des langfristigen Vitamin-K-Status zu berechnen, unFII, ucFII:iFII und inFII:aFII. Diese stellen unterschiedliche mathematische Maße des Grades der Faktor-II-Untercarboxylierung dar. Eine prospektive Analyse von Plasma-Vitamin K1, PIVKA II und ucOC ist nicht geplant, wird aber für den Fall, dass Daten benötigt werden, in Reserve gehalten.

Messung von K-Säure I und II im Urin: Die Quantifizierung von K-Säure I und II und Kreatinin (Cr) in Spot-Urinproben wird unter Verwendung eines validierten LC-MS/MS-Assays durchgeführt, den die Forscher kürzlich entwickelt haben. Das gesamte und individuelle K-Säure/Cr-Verhältnis im Urin wird berechnet.

Statistischer Analyseplan: Die Prüfärzte führen einen ungepaarten t-Test durch, um die mittlere Reaktion auf eine Vitamin-K-Ergänzung in den beiden CYP4F2-Genotypgruppen zu vergleichen. Das Ansprechen ist definiert als die Fläche unter dem Vitamin-K-Statuswert x Zeitkurve, korrigiert um den Ausgangswert, für den 10-tägigen Interventionszeitraum. Eine sekundäre Metrik ist die absolute Spitzenänderung im Verhältnis des Vitamin-K-Status. Sowohl kurzzeitige (Harn-K-Säure/Cr-Verhältnis) als auch langfristige (ucFII:iFII und inFII:aFII) Biomarker werden separat getestet. Basierend auf Pilotdaten ergibt eine Stichprobengröße von 14 in jeder Genotypgruppe eine Power von mindestens 80 %, um eine signifikante Wirkung auf dem Signifikanzniveau 0,05 zu erkennen, wenn es einen zweifachen Unterschied in der Reaktion auf die Supplementierung gibt.