Estudio de Suplementación de Vitamina K en Voluntarios Sanos (Objetivo 2B)

Los investigadores estudiarán el efecto de la suplementación con vitamina K en dos biomarcadores de la concentración hepática de vitamina K en grupos con genotipo CYP4F2*3 definido. Específicamente, los investigadores probarán una asociación entre nuestros biomarcadores novedosos de concentración de vitamina K hepática a largo plazo (proteoformas del factor II del plasma) y a corto plazo (catabolitos del ácido K urinario) y CYP4F2*3 después de un período de 10 días de tratamiento con vitamina K. Suplementación de K en voluntarios sanos.

Los investigadores reclutarán, mediante anuncios publicados en UWMC, voluntarios sanos masculinos y femeninos. Se empleará un proceso de selección de dos pasos. Los sujetos se autoseleccionarán respondiendo a los volantes y se comunicarán con el coordinador de investigación. El coordinador de investigación evaluará su elegibilidad por teléfono y, si son elegibles, programará una cita para la primera visita del estudio. Para la primera fase, el Coordinador de Investigación recolectará un hisopo bucal de ADN de ~ 200 candidatos elegibles; se analizará el ADN para determinar la ausencia o presencia del alelo variante CYP4F2*3. El PI y el coordinador de investigación revisarán los resultados del genotipado y luego seleccionarán 14 individuos con un genotipo CYP4F2*3 homocigoto o un genotipo CYP4F2*1/*3 heterocigoto, y un grupo de 14 emparejados demográficamente con un genotipo CYP4F2*1 homocigoto en el locus diagnóstico para la fase de suplementación del estudio. El coordinador del estudio luego se comunicará con estos sujetos por teléfono para la participación en la Fase II.

Procedimientos - Fase I, Recolección de hisopos bucales para aislamiento de ADN.

Cuestionario demográfico: la herencia, la edad y el sexo autoinformados se recopilarán a través de un breve cuestionario demográfico.

Hisopo bucal: recolectaremos células de la mejilla con un hisopo de algodón y aislaremos el ADN y analizaremos los alelos CYP4F2*1 y CYP4F2*3.

Genotipado: el genotipo CYP4F2 se determinará mediante un ensayo TaqMan validado (ABI/ThermoFisher Scientific), utilizando sondas de hibridación de ADN disponibles comercialmente para probar la ausencia o presencia del alelo CYP4F2*3. Los sujetos que tengan un genotipo CYP4F2*3 homocigoto o un genotipo CYP4F2*1/*3 heterocigoto y alelos CYP4F2*3 serán elegibles para la Fase II.

Procedimientos - Fase II, Suplementación con Vitamina K.

Suplementos de vitamina K: Los participantes de la investigación seleccionados para el estudio de suplementos en función del genotipo CYP4F2 recibirán 1 mg/día de filoquinona (Vitacost; Natures Life K-1 Phylloquinone) durante 10 días consecutivos. Cada dosis se tomará por la mañana (~ 8 am), con media pinta de leche al 2% para facilitar la absorción.

Recolección de muestras: para el estudio de suplementación, se recolectará una muestra de sangre venosa (tubo de EDTA de 10 ml) y una muestra de orina después de un ayuno nocturno del día 1 al día 5 y el día 8 y día 10 de suplementos de vitamina K durante 10 días. El plasma se aislará y ambas muestras se almacenarán a -70 °C hasta su análisis. A las mujeres en edad fértil se les realizará una prueba de embarazo en orina de d1 y, si es positiva, se las retirará del estudio y se destruirán todas las muestras y datos.

Medición de las proteoformas del factor II plasmático: la concentración plasmática de las 11 proteoformas individuales del factor II se medirá mediante LC-MS/MS. Estos datos se utilizarán para calcular tres métricas del estado de vitamina K a largo plazo, unFII, ucFII:iFII e inFII:aFII. Estos representan diferentes medidas matemáticas del grado de subcarboxilación del Factor II. El análisis prospectivo de vitamina K1, PIVKA II y ucOC en plasma no está planificado, pero se mantendrá en reserva en caso de que surja la necesidad de esos datos.

Medición de K-Acid I y II en orina: se realizará la cuantificación de K-Acid I y II, y creatinina (Cr) en muestras de orina puntuales, utilizando un ensayo LC-MS/MS validado que los investigadores han desarrollado recientemente. Se calculará la proporción de ácido K/Cr urinario total e individual.

Plan de análisis estadístico: los investigadores realizarán una prueba t no pareada para comparar la respuesta media a la suplementación con vitamina K en los dos grupos de genotipo CYP4F2. La respuesta se define como el área bajo el valor del estado de vitamina K x la curva de tiempo, corregida para la línea de base, durante el período de intervención de 10 días. Una métrica secundaria será el cambio máximo absoluto en la proporción del estado de la vitamina K. Tanto los biomarcadores a corto plazo (índice K-ácido/Cr urinario) como a largo plazo (ucFII:iFII e inFII:aFII) se analizarán por separado. Con base en datos piloto, un tamaño de muestra de 14 en cada grupo de genotipo proporcionará un poder de al menos el 80 % para detectar un efecto significativo en el nivel de significancia de 0,05, cuando hay una diferencia del doble en la respuesta a la suplementación.