Immunmonitoring allogén hematopoietikus őssejt-transzplantáció után

Végpontok tanulmányozása

A vizsgálat elsődleges végpontja a keringő sejtek kimutatása áramlási citometriával az allogén őssejt-transzplantáció előtt és után. A következő sejteket elemezzük: mieloid dendritikus sejtek, plazmacitoid dendritikus sejtek, CD16+ dendritikus sejtek, CD14+ monociták, CD14+/CD16+ monociták, teljes T limfociták, teljes T helper limfociták, központi memória, naiv, effektor memória és effektor T helper limfociták, összes limfociták, központi memória, naiv, effektor memória és effektor T citotoxikus limfociták, CD16+/CD56+ NK sejtek, B limfociták, T szabályozó limfociták.

A másodlagos végpontok a következők:

• Citokinek (TNFα, IFNγ, IL-4) és kemokinek (MIP és MCP csoport) szérumkoncentrációjának meghatározása.
• Autoantitestek meghatározása a szérumban. Az első fázisban a szűrőelemzést antinukleáris antitestek (ANA) és anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens) ellenanyagok keresésével végezzük. A pozitív eredményeket második szintű elemzésnek vetjük alá. Ezután folytatjuk a különböző szervspecifikus autoantitestek elemzését, amelyek korábban krónikus GVHD-vel társultak, mint a máj antitestek (SMA, AMA, SLA), anti-kardiolipin és béta2 mikroglobulin antitestek, pajzsmirigy és gyomor parietális sejtjei elleni antitestek.
• CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a és CD49d molekulák expressziójának vizsgálata monocitákban és dendritikus sejtekben.
• TNF és IL-12 termelésének vizsgálata tisztított monociták által
• Tisztított monociták allostimuláló aktivitásának vizsgálata allogén CD4+ T-sejtekkel szemben.
• A tisztított monocita receptorok által közvetített fagocitózis, makropinocitózis és endocitózis antigénbefogásának és feldolgozásának vizsgálata.
• CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) molekulák expressziójának tanulmányozása, 1-es és 2-es típusú T-helper sejtek differenciálódási molekuláinak és T-szabályozó sejtek asszociációjának vizsgálata, molekulák tanulmányozása Sejthalál asszociált.
• A citokinek proliferációjának és termelésének (beleértve az IL-2-t, IL-5-öt, IFNγ-t és IL-10-et), valamint a perforin és a granzim felszabadulásának vizsgálata mitogénekkel történő stimuláció után.
• Az antigén-specifikus T-limfociták válaszának vizsgálata pentamerekkel a HY-antigén kimutatására ELISPOT-vizsgálattal. A recipiens sejtjeit összegyűjtik és tárolják a transzplantáció előtt
• Mikro (mi) RNS PCR vizsgálata a páciens szérumában és sejtjeiben.
• Transzplantált monociták génexpressziós profiljának PCR és Microarray vizsgálata

Dizájnt tanulni

Megfigyelési egyközpontú prospektív vizsgálat emberi szövetek felhasználásával allogén őssejt-transzplantáció utáni in vitro vizsgálatokhoz. A tanulmány retrospektív szakaszt tartalmaz. A vizsgálathoz a páciens perifériás vérmintáját kell gyűjteni:

• osztályra lépéskor
• 1 hónapos átültetés után
• 3, 6, 9, 12 hónapos transzplantáció után

Tanulmányi populáció

Az Intézetünkben allogén transzplantáción átesett összes beteg szerepel.

Vérminták gyűjtése és feldolgozása

Minden perifériás vérmintát három heparin csőbe (legfeljebb 18 ml SP) és egy nem antikoaguláns csőbe (6 ml összesen legalább 3 ml szérumhoz) kell gyűjteni.

Minden mintát a következőképpen dolgozunk fel:

Az antikoaguláns nélkül vett vérmintát centrifugálják a szérum előállításához, a szérum alikvotjait lefagyasztják és -20°C-on tárolják. Az említett sejtek számának és funkciójának immunfenotípusos analízisét friss PB mintákon a gyűjtést követő 72 órán belül elvégezzük.

A mononukleáris sejteket és monocitákat standard eljárásokkal tisztítják (MNC-ket sűrűséggradiens centrifugálással, monocitákat immunmágneses szelekcióval), majd folyékony nitrogénben tárolják, amíg fel nem használják őket a várható funkcionális vizsgálatokhoz. A negatív CD14-frakciót lefagyasztják, és T-limfociták forrásaként használják.

Áramlási citometriai elemzés

Az immunrendszer keringő sejtjeinek számát és fenotípusát áramlási citometriával határozzuk meg specifikus monoklonális antitestek felhasználásával. A következő immunsejteket tekintjük:

• CD4+ és CD8+ T limfociták, beleértve a T naiv limfociták (CD45RA + CCR7 +), "effektor" memória limfociták (CD45RA-CCR7-), "centrális" memória limfociták (CD45RA-CCR7 +) és effektor limfociták (CD45RA-CCR7 +).
• T szabályozó limfociták (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B-limfociták (CD19+)
• NK sejtek (CD56 + CD16-) és citotoxikus (CD56 + CD16 +) sejtek.
• Mieloid dendritikus sejtek CD11c + (vonal-, DR +, CD33 +), plazmacitoid dendritikus sejtek (vonal-, DR +, CD33- és CD123 +) és monocitoid (CD33 +, CD14-, CD16 +) DC-k.
• Gyulladásos (CD14 + CD16 +) és összetevői (CD14 + CD16-) monociták

Funkcionális vizsgálatok tisztított monocitákon

• A TNF alfa és az IL12 termelést áramlási citometriával mérjük.
• Az allostimuláló funkciót vegyes leukocita tenyészetekben határozzuk meg, HLA különböző CD4 + T limfocitákat használva "válaszadóként".
• Az antigének befogásának képességét az egyes sejtek áramlási citometriájában mérik fluoreszcens antigénekkel, például FITC-vel konjugált albuminnal vagy fluoreszcens gyöngyökkel.
• A génexpressziós profilt MICROARRAY vizsgálattal végezzük

Funkcionális vizsgálatok tisztított T-limfocitákon

• Az aktivációs, differenciálódási és apoptózis molekulák expresszióját citometriával határozzuk meg
• A citokintermelést egyszínű áramlási citometriával határozzuk meg anti-CD3 és anti-CD28 stimuláció után.
• Női donortranszplantációban részesülő HLA-A2 pozitív férfi betegekben a T anti-HY limfociták gyakoriságát fluorokróm-konjugált pentamerekkel mérjük.
• Az összes többi betegnél a receptor antigénekre adott T-sejtdonor-választ ELISPOT-ban mérik.

Szérum citokinek tanulmány

A szérum citokinek koncentrációját citometriával határozzuk meg CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA) alkalmazásával. A következő citokineket elemezzük:

• T-helper 1 citokinek: TNF-alfa, IFN-gamma és IL-12;
• T-helper 2 és szabályozó citokinek (IL-10, IL-5) és TGF-béta
• Kemokinek: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa és MIP1-béta; IL-8, IP-10.

Szérum autoantitestek vizsgálata

Az antinukleáris antitestek koncentrációját indirekt immunfluoreszcenciával mérjük HEp2 sejteken (a hepatocarcinoma sejtvonala). Az extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitesteket ELISA-val (ENA SCREENING) mérik. Pozitivitás esetén a specifikus antigének elleni antitestek jelenlétét DOT BLOT segítségével határozzuk meg.

mikro(mi) RNS PCR vizsgálat a beteg szérumában és sejtjeiben

A teljes RNS-t kivonják a humán szérummintákból, és -80 °C-on tárolják. Az RNS egy részét (3 µl) reverz transzkripcióra és előamplifikációra dolgozzák fel primerkészlettel a szállító leírása szerint. 664 humán miRNS, 6 kis humán RNS és 1 kontroll miRNS feldolgozása párhuzamosan történik.

Génexpressziós profil Transzplantált beteg monocitáinak vizsgálata PCR és MICROARRAY segítségével

A monocita RNS hírvivőt kivonják a sejtekből, reverz transzkriptázzal cDNS-vé alakítják, és egyidejűleg fluoreszcens próbával megjelölik. A mátrixon jelenlévő nukleinsavak (próbák) és a cDNS-célpont közötti hibridizáció hibridizált marad, majd azonosítható a kötődés helyének kimutatásával. A vizsgálat végén minden mintát megsemmisítenek.

Egyidejű kezelések

A betegek a jelenlegi klinikai gyakorlatnak megfelelően kemoterápiát kapnak vagy kaptak a transzplantáció előkészítéséhez. A transzplantáció után a betegek a klinikai gyakorlatnak megfelelően gyógyszert kapnak a GVHD és fertőzések megelőzésére. Az esetlegesen a klinikai gyakorlatnak megfelelően alkalmazott egyidejű terápiákat a CRF dokumentálja.

Látogatások és értékelések ütemezése

Beteglátogatás várható, a CRF a beiratkozáskor fejeződik be. Betegenként 6 vérminta van. A beiratkozást követő bármely vérvétel 14 nappal késleltethető vagy előre jelezhető

Laboratóriumi tesztek

A teszteket a normál ellátási mód szerint végzik, és nem tanulmányspecifikusak. A vérvizsgálati információkat a CRF-eken jelentik.

Statisztikai analízis

A vizsgálat elsődleges végpontja a keringő immunsejtek számának mérése PB-ben az allogén hematopoietikus őssejt-transzplantáció előtt és után. A statisztikai elemzés az átlagok összehasonlító elemzéséből áll, a GRAPH PAD PRISM 4.02 program segítségével. A szignifikancia szintje <.05 A másodlagos végpontok elemzése ugyanazokkal a módszerekkel történik.

Minta nagysága

A vizsgálatot minden allogén transzplantáción áteső beteg számára javasolják. A Seràgnoli Intézetben évente átlagosan 50-60 transzplantációt hajtanak végre. Ezért a becslések szerint 300 beteget vonnak be a vizsgálatba.

Adminisztratív eljárások

A jegyzőkönyv bármilyen módosítása a módosítás formájában történik. A vizsgálati időszak alatt a protokoll más jellegű módosítása nem megengedett. A vizsgálatban bekövetkezett minden váratlan változás rögzítésre kerül a klinikai vizsgálati jelentésben.

A tájékozott beleegyezés kezelése

Minden beteg a normál ellátási útvonalon biztosított vizitek egyikén belül kelt és írja meg a Tájékozott hozzájárulást. Az elhunyt betegek esetében az adatfeldolgozás az Etikai Bizottság által a tanulmány jóváhagyásával engedélyezett, az általános felhatalmazás alapján (Hivatalos Lap 72, 2012.03.26.)

Dokumentációs archívum

A vizsgálatvezető felelős a vizsgálat lényeges dokumentumainak tárolásáért a vizsgálat befejezése vagy befejezése előtt, alatt és után, a vonatkozó jogszabályok és GCP-k által előírt időn belül.

A CRF-ben gyűjtött adatok szigorúan névtelenek, és az alany csak számmal és kezdőbetűvel azonosítható.

A vizsgálónak meg kell őriznie a beteg eredeti adatait és a tájékozott írásbeli hozzájárulását.

Ellenőrzések / Audit

Ha a szabályozó hatóság ellenőrzést ír elő, a vizsgálónak haladéktalanul értesítenie kell az Etikai Bizottságot.

Az eredmények közzététele

A kísérlet eredményeit a befejezést követő tizenkét hónapon belül teszik közzé.