Immuunbewaking na allogene hematopoëtische stamceltransplantatie

Bestudeer eindpunten

Het primaire eindpunt van de studie is detectie van circulerende cellen door middel van flowcytometrie voor en na allogene stamceltransplantatie. We analyseren de volgende cellen: Myeloïde dendritische cellen, plasmacytoïde dendritische cellen, CD16+ dendritische cellen, CD14+ monocyten, CD14+/CD16+ monocyten, totaal T-lymfocyten, totaal T-helperlymfocyten, centraal geheugen, naïef, effectorgeheugen en effector T-helperlymfocyten, totaal cytotoxisch lymfocyten, centraal geheugen, naïef, effectorgeheugen en effector T cytotoxische lymfocyten, CD16+/CD56+ NK-cellen, B-lymfocyten, T-regulerende lymfocyten.

De secundaire eindpunten zijn:

• Bepaling van de serumconcentratie van Cytokines (TNFα, IFNy, IL-4) en Chemokines (MIP- en MCP-groep).
• Bepaling van auto-antilichamen in het serum. In de eerste fase wordt een screeningsanalyse uitgevoerd door te zoeken naar antinucleaire antilichamen (ANA) en antilichamen anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Positieve resultaten worden onderworpen aan analyse op het tweede niveau. Vervolgens gaan we verder met de analyse van verschillende orgaanspecifieke auto-antilichamen, eerder geassocieerd met chronische GVHD, zoals leverantilichamen (SMA, AMA, SLA), anti-cardiolipine en beta2 microglobuline-antilichamen, antilichamen tegen schildklier- en maagwandcellen.
• Studie van de expressie van CD86-, CXCR4-, CCR2-, CCR5-, CD11a- en CD49d-moleculen in monocyten en dendritische cellen.
• Studie van TNF- en IL-12-productie door gezuiverde monocyten
• Studie van allostimulerende activiteit van gezuiverde monocyten tegen allogene CD4+ T-cellen.
• Studie van het vangen en verwerken van antigeen door fagocytose, macropinocytose en endocytose gemedieerd door gezuiverde monocytreceptoren.
• Studie van expressie van CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) moleculen, studie van differentiatiemoleculen type 1 en type 2 T-helpercellen en geassocieerde T-regulerende cellen, studie van moleculen die geassocieerd zijn met cellulaire dood.
• Studie van proliferatie en productie van cytokines (inclusief IL-2, IL-5, IFNγ en IL-10) en afgifte van perforine en granzyme na stimulatie met mitogenen.
• Studie van antigeen-specifieke T-lymfocytenrespons door pentameren voor detectie van HY-antigeen door ELISPOT-assay. De cellen van de ontvanger worden vóór de transplantatie verzameld en opgeslagen
• PCR-studie van micro(mi)RNA in serum en cellen van patiënt.
• PCR en Microarray studie van genexpressieprofiel van getransplanteerde monocyten

Studie ontwerp

Observationeel prospectief onderzoek in één centrum waarbij menselijke weefsels worden gebruikt voor in vitro onderzoek na allogene stamceltransplantatie. Het onderzoek omvat een retrospectieve fase. De studie vereist dat de perifere bloedmonsters van de patiënt worden geoogst:

• bij binnenkomst op de afdeling
• na 1 maand transplantatie
• na 3, 6, 9,12 maanden transplantatie

Studie Bevolking

Alle patiënten die in ons instituut een allogene transplantatie ondergaan, zijn inbegrepen.

Verzamelen en verwerken van bloedmonsters

Elk perifeer bloedmonster moet worden verzameld in drie heparinebuizen (tot 18 ml SP) en een niet-anticoagulansbuis (6 ml voor een totaal van ten minste 3 ml serum).

Elk monster wordt als volgt verwerkt:

Bloedmonsters genomen zonder antistollingsmiddel worden gecentrifugeerd om serum te verkrijgen, de aliquots van serum worden ingevroren en bewaard bij -20°C. De immunofenotypische analyse voor het aantal en de functie van de genoemde cellen wordt uitgevoerd op verse PB-monsters binnen 72 uur na afname.

Mononucleaire cellen en monocyten worden gezuiverd volgens standaardprocedures (MNC's door centrifugatie met dichtheidsgradiënt, monocyten door immunomagnetische selectie) en vervolgens bewaard in vloeibare stikstof totdat ze worden gebruikt voor verwachte functionele assays. De negatieve CD14-fractie wordt ingevroren en gebruikt als de bron van T-lymfocyten.

Flowcytometrie-analyse

Het aantal en het fenotype van de circulerende cellen van het immuunsysteem worden bepaald door flowcytometrie met behulp van de specifieke monoklonale antilichamen. We worden beschouwd als de volgende immuuncellen:

• CD4+ en CD8+ T-lymfocyten waaronder T-naïeve lymfocyten (CD45RA + CCR7+) "effector" geheugenlymfocyten (CD45RA-CCR7-), "centrale" geheugenlymfocyten (CD45RA-CCR7+) en effectorlymfocyten (CD45RA-CCR7+).
• T-regulerende lymfocyten (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B-lymfocyten (CD19+)
• NK-cellen (CD56+CD16-) en cytotoxische (CD56+CD16+) cellen.
• Myeloïde dendritische cellen CD11c+ (lineage-, DR+, CD33+), plasmacytoïde dendritische cellen (lineage-, DR+, CD33- en CD123+) en monocytoïde (CD33+, CD14-, CD16+) DC's.
• Inflammatoire (CD14 + CD16 +) en bestanddelen (CD14 + CD16-) monocyten

Functionele studies op gezuiverde monocyten

• De productie van TNF alfa en IL12 wordt gemeten in flowcytometrie.
• De allostimulerende functie wordt bepaald in gemengde leukocytenkweken met behulp van HLA verschillende CD4+ T-lymfocyten als "responders".
• Het vermogen om antigenen te vangen wordt gemeten in flowcytometrie op individuele cellen door middel van fluorescentie-antigenen, zoals FITC-geconjugeerd albumine of fluorescerende bolletjes.
• Het genexpressieprofiel wordt uitgevoerd met behulp van een MICROARRAY-studie

Functionele studies op gezuiverde T-lymfocyten

• De expressie van activerings-, differentiatie- en apoptosemoleculen wordt bepaald door cytometrie
• Cytokineproductie wordt bepaald in eenkleurige flowcytometrie na stimulatie met anti-CD3 en anti-CD28.
• Bij positieve mannelijke HLA-A2-patiënten die een vrouwelijke donortransplantatie ondergaan, wordt de frequentie van T-anti-HY-lymfocyten gemeten met fluorochroom-geconjugeerde pentameren.
• Bij alle andere patiënten wordt de T-celdonorrespons op receptorantigenen gemeten in ELISPOT.

Onderzoek naar serumcytokines

De concentratie van serumcytokines wordt bepaald in cytometrie met behulp van CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, VS). We analyseren de volgende cytokines:

• T-helper 1 cytokinen: TNF-alfa, IFN-gamma en IL-12;
• T-helper 2 en regulatoren cytokinen (IL-10, IL-5) en TGF-bèta
• Chemokines: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa en MIP1-bèta; IL-8, IP-10.

Serum auto-antilichamen Studie

De concentratie van de antinucleaire antilichamen wordt gemeten door indirecte immunofluorescentie op HEp2-cellen (een cellijn van hepatocarcinoom). De antilichamen tegen extraheerbare nucleaire antigenen (ENA) worden gemeten met ELISA (ENA SCREENING). In het geval van positiviteit wordt de aanwezigheid van antilichamen tegen specifieke antigenen bepaald door DOT BLOT.

micro(mi)RNA PCR-onderzoek in serum en cellen van patiënt

Het totale RNA wordt geëxtraheerd uit menselijke serummonsters en bewaard bij -80°C. Een deel van het RNA (3 µl) wordt verwerkt voor reverse transcriptie en pre-amplificatie met een pool van primers volgens de beschrijving van de leverancier. 664 menselijke miRNA's, 6 kleine menselijke RNA's en 1 controle-miRNA worden parallel verwerkt.

Genexpressieprofiel Studie van de monocyten van getransplanteerde patiënten door middel van PCR en MICROARRAY

De monocyt-RNA-boodschapper wordt uit de cellen geëxtraheerd, omgezet in cDNA door reverse transcriptase en tegelijkertijd gelabeld met een fluorescerende sonde. De hybridisatie tussen de nucleïnezuren (probes) aanwezig op de matrix en het cDNA-doel blijft gehybridiseerd en kan vervolgens worden geïdentificeerd door de locatie te detecteren waar het is gebonden. Aan het einde van het onderzoek worden alle monsters vernietigd.

Gelijktijdige behandelingen

Patiënten zullen volgens de huidige klinische praktijk chemotherapie krijgen of hebben gekregen ter voorbereiding op de transplantatie. Na transplantatie krijgen patiënten medicatie voor profylaxe van GVHD en infecties volgens de klinische praktijk. Gelijktijdige therapieën die mogelijk worden toegediend volgens de klinische praktijk, zijn gedocumenteerd in CRF.

Schema van bezoeken en evaluaties

Patiëntbezoek wordt verwacht en CRF wordt voltooid bij de inschrijving. Er zijn 6 bloedmonsters per patiënt. Elke bloedafname na de inschrijving kan met 14 dagen worden uitgesteld of vervroegd

Laboratorium testen

Testen vinden plaats in het reguliere zorgtraject en zijn niet studiespecifiek. Bloedonderzoekinformatie wordt gerapporteerd op CRF's.

statistische analyse

Het primaire eindpunt van de studie is de meting van het aantal circulerende immuuncellen in PB voor en na allogene hematopoëtische stamceltransplantatie. Statistische analyse bestaat uit vergelijkingsanalyse tussen gemiddelden met behulp van het programma GRAPH PAD PRISM versie 4.02. Het significantieniveau wordt gedefinieerd als <0,05 Analyse van secundaire eindpunten wordt uitgevoerd met dezelfde methoden.

Steekproefgrootte

De studie wordt voorgesteld aan alle patiënten die een allogene transplantatie ondergaan. Het aantal transplantaties dat bij het Seràgnoli Instituut wordt uitgevoerd ligt gemiddeld tussen de 50 en 60 per jaar. Daarom wordt geschat dat 300 patiënten zullen worden opgenomen in de studie.

Administratieve procedures

Elke wijziging van het protocol zal worden aangebracht in de vorm van de wijziging. Tijdens de onderzoeksperiode zijn geen andere soorten wijzigingen aan het protocol toegestaan. Alle onverwachte veranderingen in de studie worden vastgelegd in het Clinical Study Report.

Beheer van geïnformeerde toestemming

Alle patiënten daten en schrijven de geïnformeerde toestemming binnen een van de bezoeken die door het normale zorgpad worden aangeboden. Voor overleden patiënten wordt aangenomen dat de gegevensverwerking is toegestaan ​​met de goedkeuring van de studie door de ethische commissie, volgens de algemene machtiging (Publicatieblad 72 van 26/03/2012)

Documentatie archief

De hoofdonderzoeker is verantwoordelijk voor het opslaan van de essentiële documenten van het onderzoek vóór, tijdens en na de voltooiing of beëindiging van het onderzoek, in overeenstemming met de tijd die vereist is door de toepasselijke wetgeving en GCP's.

De gegevens die in het CRF worden verzameld, zijn strikt anoniem en de betrokkene wordt alleen geïdentificeerd met een nummer en initialen.

De onderzoeker zal de originele gegevens van de patiënt en de geïnformeerde schriftelijke toestemming moeten bewaren.

Inspecties / audits

Als een regelgevende instantie een inspectie vereist, moet de onderzoeker de ethische commissie hiervan onmiddellijk op de hoogte stellen.

Publicatie van resultaten

De resultaten van het experiment worden binnen twaalf maanden na de afsluiting gepubliceerd.