동종 조혈모세포 이식 후 면역 모니터링

연구 종점

연구의 1차 종점은 동종이계 줄기 세포 이식 전후에 유동 세포측정법에 의한 순환 세포의 검출입니다. 다음 세포를 분석합니다: 골수 수지상 세포, 형질세포양 수지상 세포, CD16+ 수지상 세포, CD14+ 단핵구, CD14+/CD16+ 단핵구, 총 T 림프구, 총 T 헬퍼 림프구, 중앙 기억, 나이브, 이펙터 메모리 및 이펙터 T 헬퍼 림프구, 총 세포 독성 림프구, 중앙 기억, 나이브, 효과기 기억 및 효과기 T 세포독성 림프구, CD16+/CD56+ NK 세포, B 림프구, T 조절 림프구.

보조 엔드포인트는 다음과 같습니다.

• 사이토카인(TNFα, IFNγ, IL-4) 및 케모카인(MIP 및 MCP 그룹)의 혈청 농도 결정.
• 혈청 내 자가항체 측정. 1단계에서는 항핵항체(ANA)와 항체 항-ENA(Extractable Nuclear Antigens)를 검색하여 스크리닝 분석을 수행한다. 긍정적인 결과는 2단계 분석을 거칩니다. 다음으로 간 항체(SMA, AMA, SLA), 항카디오리핀 및 베타2 마이크로글로불린 항체, 갑상선 및 위벽 세포에 대한 항체와 같이 이전에 만성 GVHD와 관련된 다양한 장기 특이적 자가항체의 분석을 진행합니다.
• 단핵구 및 수지상 세포에서의 CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a 및 CD49d 분자 발현 연구.
• 정제된 단핵구에 의한 TNF 및 IL-12 생산 연구
• 동종이계 CD4+ T 세포에 대한 정제된 단핵구의 동종자극 활성 연구.
• 정제된 단핵구 수용체에 의해 매개되는 식균작용, 거대음작용 및 세포내이입에 의한 항원 포획 및 처리에 대한 연구.
• CD134(0X40L), CD154(CD40L) 분자 발현 연구, 분화 분자 유형 1 및 유형 2 T 헬퍼 세포 및 T 조절 세포 관련 연구, 세포 사멸 관련 분자 연구.
• 미토겐으로 자극한 후 사이토카인 증식 및 생성(IL-2, IL-5, IFNγ 및 IL-10 포함) 및 퍼포린 및 그랜자임 방출에 대한 연구.
• ELISPOT 분석에 의한 HY 항원 검출을 위한 펜타머에 의한 항원 특이적 T 림프구 반응 연구. 수혜자의 세포는 이식 전에 수집 및 보관됩니다.
• 환자의 혈청 및 세포 내 마이크로(mi) RNA의 PCR 연구.
• 이식된 단핵구의 유전자 발현 양상에 대한 PCR 및 Microarray 연구

연구 설계

동종 줄기 세포 이식 후 체외 연구를 위해 인간 조직을 사용하는 관찰 단일 센터 전향적 연구. 이 연구에는 회고적 단계가 포함됩니다. 이 연구에서는 환자의 말초 혈액 샘플을 채취해야 합니다.

• 학과에 입학하면서
• 이식 1개월 후
• 이식 3, 6, 9,12개월 후

연구 인구

우리 연구소에서 동종 이식을 받는 모든 환자가 포함됩니다.

혈액 샘플 수집 및 처리

각 말초 혈액 샘플은 3개의 헤파린 튜브(최대 18ml의 SP)와 비항응고제 튜브(최소 총 3ml의 혈청에 대해 6ml)에 수집해야 합니다.

각 샘플은 다음과 같이 처리됩니다.

항응고제 없이 채취한 혈액 샘플을 원심분리하여 혈청을 얻고, 혈청 분취량을 냉동하여 -20°C에 보관합니다. 언급된 세포의 수와 기능에 대한 면역 표현형 분석은 수집 후 72시간 이내에 신선한 PB 샘플에서 수행됩니다.

단핵 세포 및 단핵구는 표준 절차(밀도 구배 원심분리에 의한 MNC, 면역자기 선택에 의한 단핵구)에 의해 정제된 다음 예상되는 기능 분석에 사용될 때까지 액체 질소에 저장됩니다. 음성 CD14 분획은 동결되어 T 림프구의 공급원으로 사용됩니다.

유세포분석

면역 체계 순환 세포의 수와 표현형은 특정 단클론 항체를 사용하는 유동 세포 계측법으로 결정됩니다. 우리는 다음과 같은 면역 세포로 간주됩니다.

• T 나이브 림프구(CD45RA + CCR7 +) "효과기" 기억 림프구(CD45RA-CCR7-), "중앙" 기억 림프구(CD45RA-CCR7 +) 및 효과기 림프구(CD45RA-CCR7 +)를 포함하는 CD4+ 및 CD8+ T 림프구.
• T 조절 림프구(CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B 림프구(CD19+)
• NK 세포(CD56 + CD16-) 및 세포독성(CD56 + CD16 +) 세포.
• 골수 수지상 세포 CD11c+(계통-, DR+, CD33+), 형질세포양 수지상 세포(계통-, DR+, CD33- 및 CD123+) 및 단핵세포(CD33+, CD14-, CD16+) DC.
• 염증성(CD14 + CD16 +) 및 구성요소(CD14 + CD16-) 단핵구

정제된 단핵구에 대한 기능 연구

• TNF 알파 및 IL12 생성은 유동 세포측정법으로 측정됩니다.
• 알로자극 기능은 "반응자"로서 HLA 상이한 CD4+T 림프구를 사용하는 혼합 백혈구 배양에서 결정된다.
• 항원을 포획하는 능력은 FITC 접합 알부민 또는 형광 비드와 같은 형광 항원에 의해 개별 세포에 대한 유동 세포 계측법에서 측정됩니다.
• 유전자 발현 프로필은 MICROARRAY 연구를 사용하여 수행됩니다.

정제된 T 림프구에 대한 기능 연구

• 활성화, 분화 및 세포 사멸 분자의 발현은 세포 계측법에 의해 결정됩니다
• 사이토카인 생성은 항-CD3 및 항-CD28로 자극한 후 단색 유세포 분석법으로 결정됩니다.
• 여성 기증자 이식을 받는 양성 남성 HLA-A2 환자에서 T 항-HY 림프구의 빈도는 형광색소 결합 오량체에 의해 측정됩니다.
• 다른 모든 환자에서 수용체 항원에 대한 T 세포 기증자 반응은 ELISPOT에서 측정됩니다.

혈청 사이토카인 연구

혈청 사이토카인의 농도는 CBA(Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA)를 사용하여 세포계산법으로 결정됩니다. 다음 사이토카인을 분석합니다.

• T-헬퍼 1 사이토카인: TNF-알파, IFN-감마 및 IL-12;
• T-헬퍼 2 및 조절자 사이토카인(IL-10, IL-5) 및 TGF-베타
• 케모카인: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-알파 및 MIP1-베타; IL-8, IP-10.

혈청 자가항체 연구

항핵 항체의 농도는 HEp2 세포(간암 세포주)에 대한 간접 면역 형광법으로 측정됩니다. 추출 가능한 핵 항원(ENA)에 대한 항체는 ELISA(ENA SCREENING)로 측정됩니다. 양성인 경우 특정 항원에 대한 항체의 존재는 DOT BLOT에 의해 결정됩니다.

환자의 혈청 및 세포에서의 micro(mi) RNA PCR 연구

전체 RNA는 인간 혈청 샘플에서 추출되어 -80°C에 보관됩니다. RNA의 일부(3µl)는 공급업체의 설명에 따라 프라이머 풀을 사용하여 역전사 및 사전 증폭을 위해 처리됩니다. 664개의 인간 miRNA, 6개의 작은 인간 RNA 및 1개의 대조군 miRNA가 병렬로 처리됩니다.

PCR 및 MICROARRAY에 의한 이식환자 단핵구의 유전자 발현 프로파일 연구

단핵구 RNA 메신저는 세포에서 추출되고, 역전사 효소에 의해 cDNA로 변환되는 동시에 형광 프로브로 표지됩니다. 매트릭스에 존재하는 핵산(프로브)과 cDNA 표적 간의 혼성화는 혼성화된 상태로 유지되며 결합된 위치를 감지하여 식별할 수 있습니다. 연구가 끝나면 모든 샘플은 폐기됩니다.

병용 치료

환자는 현재 임상 관행에 따라 이식 준비를 위해 화학 요법을 받거나 받았을 것입니다. 이식 후 환자는 임상 실습에 따라 GVHD 및 감염 예방을 위한 약물을 투여받게 됩니다. 임상 실습에 따라 투여될 수 있는 병용 요법은 CRF에 문서화되어 있습니다.

방문 및 평가 일정

환자 방문이 예상되며 등록 시 CRF가 완료됩니다. 환자당 6개의 혈액 샘플이 있습니다. 등록 후 모든 혈액 샘플은 14일까지 지연되거나 예상될 수 있습니다.

실험실 테스트

테스트는 정상적인 치료 경로에 따라 수행되며 특정 연구에 국한되지 않습니다. 혈액 검사 정보는 CRF에 보고됩니다.

통계 분석

연구의 1차 종점은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 전후의 PB에서 순환 면역 세포 수의 측정입니다. 통계 분석은 GRAPH PAD PRISM 버전 4.02 프로그램을 이용하여 평균값 간의 비교 분석으로 구성되어 있습니다. 유의 수준은 <.05로 정의됩니다. 2차 평가변수 분석은 동일한 방법을 사용하여 수행됩니다.

표본의 크기

이 연구는 동종 이식을 받는 모든 환자에게 제안됩니다. Seràgnoli Institute에서 수행되는 이식 횟수는 연간 평균 50~60회입니다. 따라서 300명의 환자가 연구에 등록될 것으로 추정됩니다.

행정 절차

프로토콜에 대한 모든 수정은 수정의 형태로 이루어집니다. 연구 기간 동안 프로토콜에 대한 다른 유형의 수정은 허용되지 않습니다. 연구의 모든 예상치 못한 변경 사항은 임상 연구 보고서에 기록됩니다.

정보에 입각한 동의 관리

모든 환자는 정상 진료 경로에서 제공하는 방문 중 한 번에 사전 동의서에 날짜를 기입하고 서면 동의서를 작성합니다. 사망한 환자의 경우 일반 승인(Official Journal 72 of 26/03/2012)에 따라 윤리위원회의 연구 승인으로 데이터 처리가 승인된 것으로 간주됩니다.

문서 아카이브

주임 연구자는 해당 법률 및 GCP에서 요구하는 시간에 따라 연구 완료 또는 종료 전, 도중 및 후에 연구의 필수 문서를 보관할 책임이 있습니다.

CRF에서 수집된 데이터는 철저히 익명이며 대상은 숫자와 이니셜로만 식별됩니다.

연구자는 환자의 원본 데이터와 고지된 서면 동의를 보관해야 합니다.

검사/감사

규제 당국이 검사를 요구하는 경우 조사자는 즉시 윤리 위원회에 알려야 합니다.

결과 발표

실험 결과는 결론 후 12개월 이내에 발표될 것입니다.