Immuunijärjestelmän seuranta allogeenisen hematopoieettisen kantasolusiirron jälkeen

Tutkimuksen päätepisteet

Tutkimuksen ensisijainen päätepiste on kiertävien solujen havaitseminen virtaussytometrialla ennen ja jälkeen allogeenisen kantasolusiirron. Analysoimme seuraavat solut: myeloidiset dendriittisolut, plasmasytoidut dendriittisolut, CD16+ dendriittisolut, CD14+ monosyytit, CD14+/CD16+ monosyytit, kokonais-T-lymfosyytit, kokonais-T-auttajalymfosyytit, keskusmuisti, naiivit, efektorimuisti ja efektori-T-auttajalymfosyytit, yhteensä lymfosyytit, keskusmuisti, naiivit, efektorimuisti ja efektori-T sytotoksiset lymfosyytit, CD16+/CD56+ NK-solut, B-lymfosyytit, T-säätelylymfosyytit.

Toissijaiset päätepisteet ovat:

• Sytokiinien (TNFα, IFNy, IL-4) ja kemokiinien (MIP- ja MCP-ryhmä) seerumipitoisuuden määritys.
• Autovasta-aineiden määritys seerumista. Ensimmäisessä vaiheessa seulontaanalyysi suoritetaan etsimällä antinukleaarisia vasta-aineita (ANA) ja vasta-aineita anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Positiiviset tulokset alistetaan toisen tason analyysiin. Seuraavaksi siirrymme erilaisten elinspesifisten autovasta-aineiden analyysiin, jotka ovat aiemmin liittyneet krooniseen GVHD:hen, kuten maksan vasta-aineet (SMA, AMA, SLA), anti-kardiolipiini- ja beeta2-mikroglobuliinivasta-aineet, vasta-aineet kilpirauhasen ja mahalaukun parietaalisoluja vastaan.
• Tutkimus CD86-, CXCR4-, CCR2-, CCR5-, CD11a- ja CD49d-molekyylien ilmentymisestä monosyyteissä ja dendriittisoluissa.
• Tutkimus TNF- ja IL-12-tuotannosta puhdistetuilla monosyyteillä
• Tutkimus puhdistettujen monosyyttien allostimulatorisesta aktiivisuudesta allogeenisiä CD4+ T-soluja vastaan.
• Tutkimus antigeenin sieppaamisesta ja prosessoinnista fagosytoosin, makropinosytoosin ja puhdistettujen monosyyttireseptorien välittämän endosytoosin avulla.
• Tutkimus CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) molekyylien ilmentymisestä, tyypin 1 ja tyypin 2 T-auttajasolujen ja T-säätelysolujen erilaistumismolekyylien tutkimus, solukuolemaan liittyvien molekyylien tutkimus.
• Tutkimus sytokiinien lisääntymisestä ja tuotannosta (mukaan lukien IL-2, IL-5, IFNy ja IL-10) ja perforiinin ja grantsyymin vapautumisesta mitogeeneillä stimuloinnin jälkeen.
• Tutkimus antigeenispesifisten T-lymfosyyttien vasteesta pentameerien avulla HY-antigeenin havaitsemiseksi ELISPOT-määrityksellä. Vastaanottajan solut kerätään ja varastoidaan ennen siirtoa
• PCR-tutkimus mikro(mi)-RNA:sta potilaan seerumissa ja soluissa.
• PCR- ja Microarray-tutkimus siirrettyjen monosyyttien geeniekspressioprofiilista

Opintojen suunnittelu

Havainnollinen yhden keskuksen prospektiivinen tutkimus, jossa käytettiin ihmiskudoksia in vitro -tutkimukseen allogeenisen kantasolusiirron jälkeen. Tutkimus sisältää retrospektiivisen vaiheen. Tutkimus edellyttää, että potilaan perifeeriset verinäytteet otetaan:

• osastolle tullessa
• 1 kuukauden siirron jälkeen
• 3, 6, 9, 12 kuukauden siirron jälkeen

Tutkimusväestö

Kaikki instituutissamme allogeenisen transplantaation saaneet potilaat ovat mukana.

Verinäytteiden kerääminen ja käsittely

Jokainen perifeerinen verinäyte on kerättävä kolmeen hepariiniputkeen (enintään 18 ml SP:tä) ja ei-antikoagulanttiputkeen (6 ml yhteensä vähintään 3 ml seerumia)

Jokainen näyte käsitellään seuraavasti:

Verinäyte, joka on otettu ilman antikoagulanttia, sentrifugoidaan seerumin saamiseksi, seerumimäärät jäädytetään ja säilytetään -20 °C:ssa. Mainittujen solujen lukumäärän ja toiminnan immunofenotyyppianalyysi suoritetaan tuoreille PB-näytteille 72 tunnin sisällä keräämisestä.

Mononukleaariset solut ja monosyytit puhdistetaan standardimenetelmillä (MNC:t tiheysgradienttisentrifugoinnilla, monosyytit immunomagneettisella valinnalla) ja säilytetään sitten nestetypessä, kunnes niitä käytetään odotettavissa oleviin toiminnallisiin määrityksiin. Negatiivinen CD14-fraktio jäädytetään ja sitä käytetään T-lymfosyyttien lähteenä.

Virtaussytometrinen analyysi

Immuunijärjestelmässä kiertävien solujen lukumäärä ja fenotyyppi määritetään virtaussytometrialla käyttämällä spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Meitä pidetään seuraavina immuunisoluina:

• CD4+- ja CD8+-T-lymfosyytit, mukaan lukien T-naiivit lymfosyytit (CD45RA + CCR7+), "efektori"-muistilymfosyytit (CD45RA-CCR7-), "keskus"muistilymfosyytit (CD45RA-CCR7+) ja efektorilymfosyytit (CD45RA-CCR7+).
• T-säätelylymfosyytit (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B-lymfosyytit (CD19+)
• NK-solut (CD56 + CD16-) ja sytotoksiset (CD56 + CD16+) solut.
• Myeloidiset dendriittisolut CD11c+ (linja-, DR+, CD33+), plasmasytoidut dendriittisolut (linja-, DR+, CD33- ja CD123+) ja monosytoidiset (CD33+, CD14-, CD16+) DC:t.
• Tulehdukselliset (CD14 + CD16 +) ja ainesosat (CD14 + CD16-) monosyytit

Toiminnalliset tutkimukset puhdistetuilla monosyyteillä

• TNF-alfan ja IL12:n tuotanto mitataan virtaussytometrialla.
• Allostimulatorinen toiminta määritetään sekaleukosyyttiviljelmissä käyttämällä HLA:n erilaisia ​​CD4+T-lymfosyyttejä "vasteina".
• Kyky siepata antigeenejä mitataan yksittäisten solujen virtaussytometriassa fluoresenssiantigeeneillä, kuten FITC-konjugoidulla albumiinilla tai fluoresoivilla helmillä.
• Geeniekspressioprofiili suoritetaan käyttämällä MICROORRAY-tutkimusta

Toiminnalliset tutkimukset puhdistetuista T-lymfosyyteistä

• Aktivaatio-, erilaistumis- ja apoptoosimolekyylien ilmentyminen määritetään sytometrialla
• Sytokiinituotanto määritetään yksivärisellä virtaussytometrialla anti-CD3:lla ja anti-CD28:lla stimuloinnin jälkeen.
• Positiivisilla miespuolisilla HLA-A2-potilailla, jotka saavat naisluovuttajasiirtoa, T-anti-HY-lymfosyyttien esiintymistiheys mitataan fluorokromikonjugoiduilla pentameereillä.
• Kaikilla muilla potilailla T-soluluovuttajavaste reseptoriantigeeneille mitataan ELISPOTilla.

Seerumin sytokiinien tutkimus

Seerumin sytokiinien pitoisuus määritetään sytometrialla käyttämällä CBA:ta (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Analysoimme seuraavat sytokiinit:

• T-auttaja 1 -sytokiinit: TNF-alfa, IFN-gamma ja IL-12;
• T-auttaja 2 ja säätelijät sytokiinit (IL-10, IL-5) ja TGF-beeta
• Kemokiinit: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa ja MIP1-beeta; IL-8, IP-10.

Seerumin autovasta-ainetutkimus

Antinukleaaristen vasta-aineiden pitoisuus mitataan epäsuoralla immunofluoresenssilla HEp2-soluista (hepatokarsinooman solulinja). Uutettavien ydinantigeenien (ENA) vasta-aineet mitataan ELISA:lla (ENA SCREENING). Positiivisuuden tapauksessa spesifisiä antigeenejä vastaan ​​olevien vasta-aineiden läsnäolo määritetään DOT BLOTilla.

mikro(mi) RNA PCR -tutkimus potilaan seerumissa ja soluissa

Kokonais-RNA uutetaan ihmisen seeruminäytteistä ja säilytetään -80 °C:ssa. Osa RNA:sta (3 µl) käsitellään käänteistranskriptiota ja esiamplifikaatiota varten alukkeiden poolilla toimittajan kuvauksen mukaisesti. 664 ihmisen miRNA:ta, 6 pientä ihmisen RNA:ta ja 1 kontrolli-miRNA:ta käsitellään rinnakkain.

Geeniekspressioprofiili Siirretyn potilaan monosyyttien tutkimus PCR:llä ja MICROARRAY:llä

Monosyytti-RNA:n lähetti uutetaan soluista, muunnetaan cDNA:ksi käänteiskopioijaentsyymin avulla ja samaan aikaan leimataan fluoresoivalla koettimella. Matriisissa olevien nukleiinihappojen (koettimien) ja cDNA-kohteen välinen hybridisaatio säilyy hybridisoituneena ja voidaan sitten tunnistaa havaitsemalla paikka, johon se on sitoutunut. Tutkimuksen päätyttyä kaikki näytteet tuhotaan.

Samanaikaiset hoidot

Potilaat saavat tai ovat saaneet solunsalpaajahoitoa elinsiirtovalmistelua varten nykyisen kliinisen käytännön mukaisesti. Elinsiirron jälkeen potilaat saavat lääkitystä GVHD:n ja infektioiden ehkäisyyn kliinisen käytännön mukaisesti. Kliinisen käytännön mukaisesti mahdollisesti annettavat samanaikaiset hoidot on dokumentoitu CRF:ssä.

Vierailujen ja arviointien aikataulu

Odotettavissa on potilaskäynti ja CRF valmistuu ilmoittautumisen yhteydessä. Potilasta kohden on 6 verinäytettä. Ilmoittautumisen jälkeistä verinäytettä voidaan lykätä tai ennakoida 14 päivää

Laboratoriotestit

Testit tehdään normaalin hoitoreitin mukaisesti, eivätkä ne ole tutkimuskohtaisia. Verikoetiedot ilmoitetaan CRF:issä.

Tilastollinen analyysi

Tutkimuksen ensisijainen päätepiste on verenkierrossa olevien immuunisolujen määrän mittaus PB:ssä ennen allogeenistä hematopoieettista kantasolusiirtoa ja sen jälkeen. Tilastollinen analyysi koostuu keskiarvojen vertailuanalyysistä käyttäen GRAPH PAD PRISM versiota 4.02 -ohjelmaa. Merkitystaso määritellään <.05 Toissijaisten päätepisteiden analyysi suoritetaan samoilla menetelmillä.

Otoskoko

Tutkimusta ehdotetaan kaikille potilaille, joille tehdään allogeeninen elinsiirto. Seràgnoli-instituutissa tehdään keskimäärin 50-60 siirtoa vuodessa. Tästä syystä tutkimukseen otetaan mukaan 300 potilasta.

Hallinnolliset menettelyt

Kaikki pöytäkirjaan tehtävät muutokset tehdään muutoksen muodossa. Mitään muunlaisia ​​muutoksia protokollaan ei sallita tutkimusjakson aikana. Kaikki odottamattomat muutokset tutkimuksessa kirjataan kliinisen tutkimuksen raporttiin.

Tietoisen suostumuksen hallinta

Kaikki potilaat päivämäärät ja kirjoittavat tietoisen suostumuksen yhden normaalin hoitopolun tarjoaman käynnin aikana. Kuolleiden potilaiden osalta katsotaan, että tietojen käsittely on valtuutettu eettisen komitean tutkimuksen hyväksynnällä yleisvaltuutuksen mukaisesti (EUVL 72, 26.3.2012)

Dokumentaatioarkisto

Päätutkija on vastuussa tutkimuksen olennaisten asiakirjojen säilyttämisestä ennen tutkimuksen päättymistä, sen aikana ja sen jälkeen soveltuvien lakien ja hyvien käytäntöjen edellyttämän ajan mukaisesti.

CRF:ään kerätyt tiedot ovat täysin anonyymejä, ja kohde tunnistetaan vain numerolla ja nimikirjaimilla.

Tutkijan tulee säilyttää potilaan alkuperäiset tiedot ja tietoinen kirjallinen suostumus.

Tarkastukset/tarkastukset

Jos valvontaviranomainen vaatii tarkastusta, tutkijan on välittömästi ilmoitettava siitä eettiselle toimikunnalle.

Tulosten julkaiseminen

Kokeen tulokset julkaistaan ​​kahdentoista kuukauden kuluessa päätöksestä.