Immunovervåking etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon

Studie endepunkter

Det primære endepunktet for studien er påvisning av sirkulerende celler ved flowcytometri før og etter allogen stamcelletransplantasjon. Vi analyserer følgende celler: Myeloid dendrittiske celler, Plasmacytoid dendrittiske celler, CD16+ dendrittiske celler, CD14+ monocytter, CD14+/CD16+ monocytter, totale T-lymfocytter, totale T-hjelperlymfocytter, sentralminne, naivt, effektorminne og effektor T-hjelperlymfocytter, total cytotoksiske lymfocytter, sentralhukommelse, naiv, effektorminne og effektor T cytotoksiske lymfocytter, CD16+/CD56+ NK-celler, B-lymfocytter, T-regulatoriske lymfocytter.

De sekundære endepunktene er:

• Bestemmelse av serumkonsentrasjonen av cytokiner (TNFα, IFNγ, IL-4) og kjemokiner (MIP og MCP gruppe).
• Bestemmelse av autoantistoffer i serum. I første fase utføres screeningsanalyse ved å søke etter anti nukleære antistoffer (ANA) og antistoffer anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Positive resultater blir gjenstand for analyse på andre nivå. Deretter går vi videre til analysen av forskjellige organspesifikke autoantistoffer, tidligere assosiert med kronisk GVHD, som leverantistoffer (SMA, AMA, SLA), anti-kardiolipin og beta2 mikroglobulin antistoffer, antistoffer mot skjoldbruskkjertelen og parietalceller i magen.
• Studie av CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a og CD49d molekylekspresjon i monocytter og dendrittiske celler.
• Studie av TNF og IL-12 produksjon av rensede monocytter
• Studie av allostimulerende aktivitet av rensede monocytter mot allogene CD4+ T-celler.
• Studie av antigenfangst og prosessering ved fagocytose, makropinocytose og endocytose mediert av rensede monocytter-reseptorer.
• Studie av CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) molekylekspresjon, studie av differensieringsmolekyler type1 og type 2 T-hjelpeceller og T-regulatoriske celler assosiert, studie av molekyler knyttet til celledød.
• Studie av cytokinproliferasjon og produksjon (inkludert IL-2, IL-5, IFNγ og IL-10) og frigjøring av perforin og granzym etter stimulering med mitogener.
• Studie av antigenspesifikk T-lymfocyttrespons av pentamerer for påvisning av HY-antigen ved ELISPOT-analyse. Mottakerens celler samles og lagres før transplantasjonen
• PCR-studie av mikro (mi) RNA i pasientens serum og celler.
• PCR og Microarray-studie av genekspresjonsprofil for transplanterte monocytter

Studere design

Observasjonell enkeltsenter prospektiv studie som bruker humant vev for in vitro-studie etter allogen stamcelletransplantasjon. Studien inkluderer en retrospektiv fase. Studien krever at pasientens perifere blodprøver høstes:

• ved å komme inn på avdelingen
• etter 1 måneds transplantasjon
• etter 3, 6, 9,12 måneder med transplantasjon

Studiepopulasjon

Alle pasienter som gjennomgår allogen transplantasjon i vårt institutt er inkludert.

Innsamling og behandling av blodprøver

Hver perifer blodprøve må samles i tre heparinrør (opptil 18 ml SP) og et ikke-antikoagulerende rør (6 ml for totalt minst 3 ml serum)

Hver prøve behandles som følger:

Blodprøve tatt uten antikoagulant vil bli sentrifugert for å oppnå serum, alikvotene av serum fryses og lagres ved -20°C. Den immunfenotypiske analysen for antall og funksjon av de nevnte cellene utføres på ferske PB-prøver innen 72 timer etter innsamling.

Mononukleære celler og monocytter renses ved standardprosedyrer (MNCs ved tetthetsgradientsentrifugering, monocytter ved immunomagnetisk seleksjon) og lagres deretter i flytende nitrogen til de brukes til forventede funksjonelle analyser. Den negative CD14-fraksjonen fryses og brukes som kilde til T-lymfocytter.

Flowcytometrianalyse

Antallet og fenotypen til immunsystemets sirkulerende celler bestemmes ved flowcytometri ved bruk av de spesifikke monoklonale antistoffene. Vi betraktes som følgende immunceller:

• CD4+ og CD8+ T-lymfocytter inkludert T-naive lymfocytter (CD45RA + CCR7 +), "effektor"-minnelymfocytter (CD45RA-CCR7-), "sentrale" minnelymfocytter (CD45RA-CCR7 +) og effektorlymfocytter (CD45RA-CCR7 +).
• T regulatoriske lymfocytter (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B-lymfocytter (CD19+)
• NK-celler (CD56 + CD16-) og cytotoksiske (CD56 + CD16+) celler.
• Myeloide dendrittiske celler CD11c+ (avstamning-, DR+, CD33+), Plasmacytoide dendrittiske celler (avstamnings-, DR+, CD33- og CD123+) og monocytoide (CD33+, CD14-, CD16+) DC-er.
• Inflammatoriske (CD14 + CD16 +) og bestanddeler (CD14 + CD16-) monocytter

Funksjonelle studier på rensede monocytter

• TNF alfa- og IL12-produksjon måles i flowcytometri.
• Den allostimulerende funksjonen bestemmes i blandede leukocyttkulturer ved å bruke HLA forskjellige CD4 + T-lymfocytter som "respondere".
• Evnen til å fange antigener måles i flowcytometri på individuelle celler ved fluorescensantigener, slik som FITC-konjugert albumin eller fluorescerende perler.
• Genekspresjonsprofilen utføres ved hjelp av en MICROARRAY-studie

Funksjonelle studier på rensede T-lymfocytter

• Uttrykket av aktiverings-, differensierings- og apoptosemolekyler bestemmes av cytometri
• Cytokinproduksjonen bestemmes i enfarget flowcytometri etter stimulering med anti-CD3 og anti-CD28.
• Hos positive mannlige HLA-A2-pasienter som får kvinnelig donortransplantasjon, måles frekvensen av T-anti-HY-lymfocytter med fluorokrom-konjugerte pentamerer.
• Hos alle andre pasienter måles T-celledonorrespons på reseptorantigener i ELISPOT.

Studie av serumcytokiner

Konsentrasjonen av serumcytokiner bestemmes i cytometri ved bruk av CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Vi analyserer følgende cytokiner:

• T-hjelper 1 cytokiner: TNF-alfa, IFN-gamma og IL-12;
• T-hjelper 2 og regulatorer cytokiner (IL-10, IL-5) og TGF-beta
• Kjemokiner: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa og MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Studie av autoantistoffer i serum

Konsentrasjonen av de antinukleære antistoffene måles ved indirekte immunfluorescens på HEp2-celler (en cellelinje av hepatokarsinom). Antistoffene mot ekstraherbare nukleære antigener (ENA) måles med ELISA (ENA SCREENING). Ved positivitet bestemmes tilstedeværelsen av antistoffer mot spesifikke antigener med DOT BLOT.

mikro(mi) RNA PCR-studie i pasientens serum og celler

Totalt RNA ekstraheres fra humane serumprøver og lagres ved -80 °C. En del av RNA (3 µl) behandles for revers transkripsjon og pre-amplifisering med en pool av primere i henhold til leverandørens beskrivelse. 664 humant miRNA, 6 små humant RNA og 1 kontroll miRNA behandles parallelt.

Genekspresjonsprofil Studie av transplanterte pasienters monocytter ved PCR og MICROARRAY

Monocytt-RNA-budbringeren ekstraheres fra cellene, omdannes til cDNA ved revers transkriptase og merkes samtidig med en fluorescerende probe. Hybridiseringen mellom nukleinsyrene (probene) som er tilstede på matrisen og cDNA-målet vil forbli hybridisert og kan deretter identifiseres ved å detektere stedet der det er bundet. Ved slutten av studien vil alle prøver bli destruert.

Samtidig behandlinger

Pasienter vil motta eller ha fått kjemoterapi for transplantasjonsforberedelse i henhold til gjeldende klinisk praksis. Etter transplantasjon vil pasienter få medisiner for profylakse av GVHD og infeksjoner i henhold til klinisk praksis. Samtidig terapi som eventuelt administreres i henhold til klinisk praksis er dokumentert i CRF.

Tidsplan for besøk og evalueringer

Pasientbesøk forventes og CRF er gjennomført ved innskrivning. Det er 6 blodprøver per pasient. Enhver blodprøve etter registreringen kan forsinkes eller forventes med 14 dager

Laboratorietester

Tester utføres under normal omsorgsvei og er ikke studiespesifikke. Blodundersøkelsesinformasjon rapporteres på CRF-er.

Statistisk analyse

Det primære endepunktet for studien er målingen av sirkulerende immuncelleantall i PB før og etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon. Statistisk analyse består av sammenligningsanalyse mellom gjennomsnitt ved bruk av programmet GRAPH PAD PRISM versjon 4.02. Signifikansnivået er definert som <.05 Analyse av sekundære endepunkter utføres ved bruk av de samme metodene.

Prøvestørrelse

Studien er foreslått for alle pasienter som gjennomgår allogen transplantasjon. Antall transplantasjoner utført ved Seràgnoli-instituttet er i gjennomsnitt mellom 50 og 60 per år. Det er derfor anslått at 300 pasienter vil bli registrert i studien.

Administrative prosedyrer

Eventuelle endringer i protokollen vil bli gjort i form av endringen. Ingen andre typer modifikasjoner av protokollen er tillatt i løpet av studieperioden. Eventuelle uventede endringer i studien vil bli registrert i den kliniske studierapporten.

Håndtering av informert samtykke

Alle pasienter daterer og skriver det informerte samtykket i et av besøkene som tilbys av den vanlige behandlingsveien. For døde pasienter anses det at databehandlingen er autorisert med godkjenning av studien av Etikkkomiteen, i henhold til generell autorisasjon (Official Journal 72 of 26/03/2012)

Dokumentasjonsarkiv

Hovedetterforskeren er ansvarlig for å lagre de essensielle dokumentene fra studien før, under og etter fullføring eller avslutning av studien, i samsvar med tiden som kreves av gjeldende lover og GCPer.

Dataene som samles inn i CRF er strengt anonyme og emnet identifiseres kun med et nummer og initialer.

Etterforskeren må beholde pasientens originale data og informerte skriftlige samtykke.

Inspeksjoner / revisjoner

Hvis en tilsynsmyndighet krever en inspeksjon, må etterforskeren umiddelbart informere den etiske komiteen.

Publisering av resultater

Resultatene av eksperimentet vil bli publisert innen tolv måneder etter konklusjonen.