Monitorování imunity po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk

Koncové body studie

Primárním koncovým bodem studie je detekce cirkulujících buněk průtokovou cytometrií před a po alogenní transplantaci kmenových buněk. Analyzujeme následující buňky: myeloidní dendritické buňky, plazmocytoidní dendritické buňky, CD16+ dendritické buňky, CD14+ monocyty, CD14+/CD16+ monocyty, celkové T lymfocyty, celkové T pomocné lymfocyty, centrální paměť, naivní, efektorové paměťové a efektorové T pomocné lymfocyty, celkové cytotoxické lymfocyty, centrální paměť, naivní, efektorové paměťové a efektorové T cytotoxické lymfocyty, CD16+/CD56+ NK buňky, B lymfocyty, T regulační lymfocyty.

Sekundární koncové body jsou:

• Stanovení sérové ​​koncentrace cytokinů (TNFα, IFNγ, IL-4) a chemokinů (skupina MIP a MCP).
• Stanovení autoprotilátek v séru. V první fázi se provádí screeningová analýza vyhledáváním antinukleárních protilátek (ANA) a protilátek anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Pozitivní výsledky jsou podrobeny analýze druhé úrovně. Dále přistoupíme k analýze různých orgánově specifických autoprotilátek, dříve spojených s chronickou GVHD, jako jsou jaterní protilátky (SMA, AMA, SLA), antikardiolipinové a beta2 mikroglobulinové protilátky, protilátky proti parietálním buňkám štítné žlázy a žaludku.
• Studium exprese molekul CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a a CD49d v monocytech a dendritických buňkách.
• Studium produkce TNF a IL-12 purifikovanými monocyty
• Studium alostimulační aktivity purifikovaných monocytů proti alogenním CD4+ T buňkám.
• Studium zachycení a zpracování antigenu fagocytózou, makropinocytózou a endocytózou zprostředkovanou purifikovanými monocytovými receptory.
• Studium exprese molekul CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), studium diferenciačních molekul typu 1 a typu 2 pomocných T buněk a asociovaných T regulačních buněk, studium molekul spojených s buněčnou smrtí.
• Studium proliferace a produkce cytokinů (včetně IL-2, IL-5, IFNγ a IL-10) a uvolňování perforinu a granzymu po stimulaci mitogeny.
• Studium odpovědi antigen-specifických T lymfocytů pomocí pentamerů pro detekci HY antigenu metodou ELISPOT. Buňky příjemce jsou odebrány a uloženy před transplantací
• PCR studie mikro (mi) RNA v pacientově séru a buňkách.
• PCR a Microarray studie profilu genové exprese transplantovaných monocytů

Studovat design

Observační jednocentrová prospektivní studie využívající lidské tkáně pro in vitro studii po alogenní transplantaci kmenových buněk. Studie zahrnuje retrospektivní fázi. Studie vyžaduje, aby byly odebrány vzorky periferní krve pacienta:

• při vstupu na oddělení
• po 1 měsíci transplantace
• po 3, 6, 9,12 měsících transplantace

Studijní populace

Jsou zahrnuti všichni pacienti podstupující alogenní transplantaci v našem ústavu.

Odběr a zpracování vzorků krve

Každý vzorek periferní krve musí být odebrán do tří heparinových zkumavek (až 18 ml SP) a neantikoagulační zkumavky (6 ml na celkem alespoň 3 ml séra)

Každý vzorek je zpracován následovně:

Vzorek krve odebraný bez antikoagulantu bude centrifugován, aby bylo získáno sérum, alikvoty séra jsou zmraženy a skladovány při -20°C. Imunofenotypová analýza počtu a funkce uvedených buněk se provádí na čerstvých vzorcích PB do 72 hodin od odběru.

Mononukleární buňky a monocyty jsou purifikovány standardními postupy (MNC centrifugací v hustotním gradientu, monocyty imunomagnetickou selekcí) a poté skladovány v kapalném dusíku, dokud nejsou použity pro očekávané funkční testy. Negativní CD14 frakce se zmrazí a použije jako zdroj T lymfocytů.

Analýza průtokovou cytometrií

Počet a fenotyp cirkulujících buněk imunitního systému se určuje průtokovou cytometrií pomocí specifických monoklonálních protilátek. Za imunitní buňky považujeme následující:

• CD4+ a CD8+ T lymfocyty včetně T naivních lymfocytů (CD45RA + CCR7 +) "efektorových" paměťových lymfocytů (CD45RA-CCR7-), "centrálních" paměťových lymfocytů (CD45RA-CCR7 +) a efektorových lymfocytů (CD45RA-CCR7 +).
• T regulační lymfocyty (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B lymfocyty (CD19+)
• NK buňky (CD56 + CD16-) a cytotoxické (CD56 + CD16 +) buňky.
• Myeloidní dendritické buňky CD11c+ (linie-, DR+, CD33+), plazmocytoidní dendritické buňky (linie-, DR+, CD33- a CD123+) a monocytoidní (CD33+, CD14-, CD16+) DC.
• Zánětlivé (CD14 + CD16 +) a složky (CD14 + CD16-) monocyty

Funkční studie na purifikovaných monocytech

• Produkce TNF alfa a IL12 se měří průtokovou cytometrií.
• Alostimulační funkce je stanovena ve smíšených kulturách leukocytů za použití HLA odlišných CD4+ T lymfocytů jako "respondérů".
• Schopnost zachytit antigeny se měří průtokovou cytometrií na jednotlivých buňkách pomocí fluorescenčních antigenů, jako je FITC konjugovaný albumin nebo fluorescenční kuličky.
• Profil genové exprese se provádí pomocí studie MICROARRAY

Funkční studie na purifikovaných T lymfocytech

• Exprese aktivačních, diferenciačních a apoptózních molekul je stanovena cytometrií
• Produkce cytokinů se stanovuje jednobarevnou průtokovou cytometrií po stimulaci anti-CD3 a anti-CD28.
• U pozitivních mužských HLA-A2 pacientů po transplantaci ženského dárce se frekvence T anti-HY lymfocytů měří pomocí pentamerů konjugovaných s fluorochromem.
• U všech ostatních pacientů se odpověď dárce T-buněk na receptorové antigeny měří v ELISPOT.

Studie sérových cytokinů

Koncentrace sérových cytokinů se stanovuje v cytometrii pomocí CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Analyzujeme následující cytokiny:

• T-helper 1 cytokiny: TNF-alfa, IFN-gama a IL-12;
• T-helper 2 a regulátory cytokinů (IL-10, IL-5) a TGF-beta
• Chemokiny: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa a MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Autoprotilátky v séru Studie

Koncentrace antinukleárních protilátek se měří nepřímou imunofluorescencí na buňkách HEp2 (buněčná linie hepatokarcinomu). Protilátky proti extrahovatelným jaderným antigenům (ENA) se měří metodou ELISA (ENA SCREENING). V případě pozitivity se přítomnost protilátek proti specifickým antigenům zjišťuje pomocí DOT BLOT.

micro(mi) RNA PCR studie v pacientově séru a buňkách

Celková RNA je extrahována ze vzorků lidského séra a skladována při -80 °C. Část RNA (3 µl) je zpracována pro reverzní transkripci a preamplifikaci pomocí poolu primerů podle popisu dodavatele. Paralelně se zpracovává 664 lidských miRNA, 6 malých lidských RNA a 1 kontrolní miRNA.

Profil genové exprese Studium monocytů transplantovaného pacienta pomocí PCR a MICROARRAY

Z buněk je extrahován monocytární RNA messenger, reverzní transkriptázou přeměněn na cDNA a současně značen fluorescenční sondou. Hybridizace mezi nukleovými kyselinami (sondami) přítomnými na matrici a cDNA cílem zůstane hybridizovaná a může být poté identifikována detekcí místa, kde je navázána. Na konci studie budou všechny vzorky zničeny.

Doprovodné léčby

Pacienti budou dostávat nebo dostávali chemoterapii pro přípravu transplantace podle současné klinické praxe. Po transplantaci budou pacienti dostávat léky na profylaxi GVHD a infekcí podle klinické praxe. Doprovodné terapie, které mohou být podávány podle klinické praxe, jsou dokumentovány v CRF.

Rozpis návštěv a hodnocení

Očekává se návštěva pacienta a CRF je dokončena při zápisu. Na jednoho pacienta připadá 6 vzorků krve. Jakýkoli odběr krve po zápisu lze odložit nebo předvídat o 14 dní

Laboratorní testy

Testy se provádějí v rámci normální péče a nejsou specifické pro studii. Informace o vyšetření krve jsou uvedeny na CRF.

Statistická analýza

Primárním koncovým bodem studie je měření počtu cirkulujících imunitních buněk v PB před a po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Statistická analýza sestává ze srovnávací analýzy mezi průměry pomocí programu GRAPH PAD PRISM verze 4.02. Hladina významnosti je definována jako < 0,05 Analýza sekundárních koncových bodů se provádí za použití stejných metod.

Velikost vzorku

Studie je navržena pro všechny pacienty podstupující alogenní transplantaci. Počet transplantací provedených v Institutu Seràgnoli se v průměru pohybuje mezi 50 a 60 ročně. Odhaduje se tedy, že do studie bude zařazeno 300 pacientů.

Administrativní postupy

Případná úprava protokolu bude provedena formou dodatku. Během období studie nejsou povoleny žádné jiné typy úprav protokolu. Jakékoli neočekávané změny ve studii budou zaznamenány ve zprávě o klinické studii.

Správa informovaného souhlasu

Všichni pacienti datují a píší informovaný souhlas v rámci jedné z návštěv poskytovaných běžným způsobem péče. U mrtvých pacientů se má za to, že zpracování údajů je povoleno se souhlasem studie Etickou komisí podle obecného oprávnění (Úřední věstník 72 ze dne 26.3.2012)

Archiv dokumentace

Hlavní zkoušející je odpovědný za uchovávání základních dokumentů studie před, během a po dokončení nebo ukončení studie v souladu s dobou vyžadovanou platnými zákony a GCP.

Údaje shromážděné v CRF jsou přísně anonymní a subjekt je identifikován pouze číslem a iniciálami.

Zkoušející si bude muset ponechat původní údaje pacienta a informovaný písemný souhlas.

Kontroly / Audity

Pokud regulační orgán vyžaduje kontrolu, musí zkoušející neprodleně informovat etickou komisi.

Publikování výsledků

Výsledky experimentu budou zveřejněny do dvanácti měsíců od uzavření.