Monitorowanie odporności po allogenicznym przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych

Punkty końcowe badania

Pierwszorzędowym punktem końcowym badania jest wykrycie krążących komórek za pomocą cytometrii przepływowej przed i po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych. Analizujemy następujące komórki: szpikowe komórki dendrytyczne, plazmocytoidalne komórki dendrytyczne, komórki dendrytyczne CD16+, monocyty CD14+, monocyty CD14+/CD16+, całkowite limfocyty T, całkowite limfocyty pomocnicze T, pamięć centralna, naiwne, efektorowe limfocyty pomocnicze pamięci i efektorowe limfocyty T pomocnicze, całkowita cytotoksyczna limfocyty pamięci centralnej, naiwne, efektorowe i efektorowe cytotoksyczne limfocyty T, komórki NK CD16+/CD56+, limfocyty B, limfocyty T regulatorowe.

Drugorzędowymi punktami końcowymi są:

• Oznaczanie stężenia w surowicy cytokin (TNFα, IFNγ, IL-4) i chemokin (grupa MIP i MCP).
• Oznaczanie autoprzeciwciał w surowicy. W pierwszej fazie wykonywana jest analiza przesiewowa poprzez poszukiwanie przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) oraz przeciwciał anty-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Wyniki pozytywne poddawane są analizie drugiego stopnia. Następnie przechodzimy do analizy różnych autoprzeciwciał narządowych, wcześniej związanych z przewlekłą GVHD, takich jak przeciwciała wątrobowe (SMA, AMA, SLA), przeciwciała przeciwko kardiolipinie i beta2-mikroglobulinie, przeciwciała przeciwko tarczycy i komórkom okładzinowym żołądka.
• Badanie ekspresji cząsteczek CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a i CD49d w monocytach i komórkach dendrytycznych.
• Badanie wytwarzania TNF i IL-12 przez oczyszczone monocyty
• Badanie aktywności allostymulującej oczyszczonych monocytów przeciwko allogenicznym limfocytom T CD4+.
• Badanie wychwytywania i przetwarzania antygenu przez fagocytozę, makropinocytozę i endocytozę za pośrednictwem oczyszczonych receptorów monocytów.
• Badanie ekspresji cząsteczek CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), badanie różnicowania cząsteczek pomocniczych komórek T typu 1 i typu 2 oraz związanych z komórkami regulatorowymi T, badanie cząsteczek związanych ze śmiercią komórkową.
• Badanie proliferacji i produkcji cytokin (w tym IL-2, IL-5, IFNγ i IL-10) oraz uwalniania perforyny i granzymu po stymulacji mitogenami.
• Badanie reakcji limfocytów T specyficznych dla antygenu przez pentamery na wykrywanie antygenu HY w teście ELISPOT. Komórki biorcy są pobierane i przechowywane przed przeszczepem
• Badanie PCR mikro (mi) RNA w surowicy i komórkach pacjenta.
• Badanie PCR i mikromacierzy profilu ekspresji genów przeszczepionych monocytów

Projekt badania

Obserwacyjne jednoośrodkowe badanie prospektywne wykorzystujące ludzkie tkanki do badań in vitro po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych. Badanie obejmuje fazę retrospektywną. Badanie wymaga pobrania próbek krwi obwodowej pacjenta:

• przy wejściu na oddział
• po 1 miesiącu przeszczepu
• po 3, 6, 9,12 miesiącach transplantacji

Badana populacja

Uwzględnieni są wszyscy pacjenci poddawani transplantacji allogenicznej w naszym Instytucie.

Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi

Każdą próbkę krwi obwodowej należy pobrać do trzech probówek z heparyną (do 18 ml SP) i probówki bez antykoagulantu (6 ml, czyli łącznie co najmniej 3 ml surowicy)

Każda próbka jest przetwarzana w następujący sposób:

Próbka krwi pobrana bez antykoagulantu zostanie odwirowana w celu uzyskania surowicy, porcje surowicy zostaną zamrożone i przechowywane w temperaturze -20°C. Analizę immunofenotypową pod kątem liczby i funkcji wspomnianych komórek przeprowadza się na świeżych próbkach PB w ciągu 72 godzin od pobrania.

Komórki jednojądrzaste i monocyty są oczyszczane standardowymi procedurami (MNC przez wirowanie w gradiencie gęstości, monocyty przez selekcję immunomagnetyczną), a następnie przechowywane w ciekłym azocie do czasu wykorzystania ich do oczekiwanych testów funkcjonalnych. Negatywną frakcję CD14 zamraża się i stosuje jako źródło limfocytów T.

Analiza metodą cytometrii przepływowej

Liczbę i fenotyp krążących komórek układu odpornościowego określa się za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu swoistych przeciwciał monoklonalnych. Za komórki odpornościowe uważa się następujące komórki:

• Limfocyty T CD4+ i CD8+, w tym limfocyty T naiwne (CD45RA + CCR7 +), limfocyty pamięci „efektorowej” (CD45RA-CCR7-), limfocyty pamięci „centralnej” (CD45RA-CCR7 +) i limfocyty efektorowe (CD45RA-CCR7 +).
• Limfocyty regulatorowe T (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• Limfocyty B (CD19+)
• Komórki NK (CD56 + CD16-) i komórki cytotoksyczne (CD56 + CD16 +).
• Szpikowe komórki dendrytyczne CD11c+ (linia-, DR+, CD33+), plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (linia-, DR+, CD33- i CD123+) i monocytoidy (CD33+, CD14-, CD16+) DC.
• Monocyty zapalne (CD14 + CD16 +) i składowe (CD14 + CD16-)

Badania funkcjonalne na oczyszczonych monocytach

• Wytwarzanie TNF alfa i IL12 mierzy się w cytometrii przepływowej.
• Funkcja allostymulacyjna jest określana w mieszanych hodowlach leukocytów przy użyciu różnych limfocytów T CD4+ HLA jako „reagujących”.
• Zdolność do wychwytywania antygenów mierzy się w cytometrii przepływowej na poszczególnych komórkach za pomocą antygenów fluorescencyjnych, takich jak albumina sprzężona z FITC lub kulki fluorescencyjne.
• Profil ekspresji genów przeprowadza się za pomocą badania MICROARRAY

Badania funkcjonalne na oczyszczonych limfocytach T

• Ekspresję cząsteczek aktywacji, różnicowania i apoptozy określa się za pomocą cytometrii
• Wytwarzanie cytokin oznacza się w jednokolorowej cytometrii przepływowej po stymulacji anty-CD3 i anty-CD28.
• U pacjentów płci męskiej z dodatnim wynikiem oznaczenia HLA-A2 otrzymujących przeszczep od kobiety, częstość występowania limfocytów T anty-HY mierzy się za pomocą pentamerów skoniugowanych z fluorochromem.
• U wszystkich innych pacjentów odpowiedź dawcy limfocytów T na antygeny receptora jest mierzona w teście ELISPOT.

Badanie cytokin w surowicy

Stężenie cytokin w surowicy oznacza się w cytometrii metodą CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Analizujemy następujące cytokiny:

• cytokiny T pomocnicze 1: TNF-alfa, IFN-gamma i IL-12;
• T-helper 2 i regulatory cytokin (IL-10, IL-5) oraz TGF-beta
• Chemokiny: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa i MIP1-beta; IŁ-8, IP-10.

Badanie autoprzeciwciał w surowicy

Stężenie przeciwciał przeciwjądrowych mierzy się metodą immunofluorescencji pośredniej na komórkach HEp2 (linia komórkowa raka wątroby). Przeciwciała przeciwko ekstrahowalnym antygenom jądrowym (ENA) są mierzone metodą ELISA (ENA SCREENING). W przypadku pozytywnego wyniku, obecność przeciwciał przeciwko określonym antygenom jest określana metodą DOT BLOT.

badanie mikro(mi) RNA PCR w surowicy i komórkach pacjenta

Całkowity RNA jest ekstrahowany z próbek surowicy ludzkiej i przechowywany w temperaturze -80°C. Część RNA (3µl) jest poddawana odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji z pulą starterów zgodnie z opisem dostawcy. 664 ludzkie miRNA, 6 małych ludzkich RNA i 1 kontrolne miRNA są przetwarzane równolegle.

Profil ekspresji genów Badanie monocytów przeszczepionego pacjenta metodą PCR i MIKROMACIERZY

Komunikator RNA monocytów jest ekstrahowany z komórek, przekształcany w cDNA przez odwrotną transkryptazę i jednocześnie znakowany sondą fluorescencyjną. Hybrydyzacja między kwasami nukleinowymi (sondami) obecnymi na matrycy i docelowym cDNA pozostanie zhybrydyzowana i może być następnie zidentyfikowana przez wykrycie miejsca, w którym jest związana. Po zakończeniu badania wszystkie próbki zostaną zniszczone.

Leczenie towarzyszące

Pacjenci będą otrzymywać lub otrzymywali chemioterapię w celu przygotowania do przeszczepu zgodnie z aktualną praktyką kliniczną. Po przeszczepie pacjenci otrzymają leki stosowane w profilaktyce GVHD i infekcji zgodnie z praktyką kliniczną. Terapie towarzyszące, które mogą być podawane zgodnie z praktyką kliniczną, są udokumentowane w CRF.

Harmonogram wizyt i ocen

Oczekiwana jest wizyta pacjenta, a CRF jest zakończona podczas rejestracji. Na jednego pacjenta przypada 6 próbek krwi. Każda próbka krwi po zapisie może być opóźniona lub wyprzedzona o 14 dni

Testy laboratoryjne

Testy są wykonywane w ramach normalnej ścieżki opieki i nie są specyficzne dla badania. Informacje o badaniu krwi są podawane w CRF.

Analiza statystyczna

Pierwszorzędowym punktem końcowym badania jest pomiar liczby krążących komórek odpornościowych w PB przed i po allogenicznym przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych. Analiza statystyczna polega na analizie porównawczej średnich przy użyciu programu GRAPH PAD PRISM w wersji 4.02. Poziom istotności definiuje się jako <0,05 Analizę drugorzędowych punktów końcowych przeprowadza się tymi samymi metodami.

Wielkość próbki

Badanie proponuje się wszystkim pacjentom poddawanym przeszczepom allogenicznym. Liczba przeszczepów wykonywanych w Instytucie Seràgnoli wynosi średnio od 50 do 60 rocznie. Szacuje się zatem, że do badania zostanie włączonych 300 pacjentów.

Procedury administracyjne

Jakakolwiek zmiana protokołu zostanie dokonana w formie aneksu. Żadne inne rodzaje modyfikacji protokołu nie są dozwolone w okresie badania. Wszelkie nieoczekiwane zmiany w badaniu zostaną odnotowane w raporcie z badania klinicznego.

Zarządzanie świadomą zgodą

Wszyscy pacjenci umawiają się i piszą Świadomą Zgodę w ramach jednej z wizyt w ramach normalnej ścieżki opieki. W przypadku pacjentów zmarłych uważa się, że przetwarzanie danych jest dozwolone za zgodą Komisji Etyki na podstawie ogólnego zezwolenia (Dz.U. 72 z 26.03.2012)

Archiwum dokumentacji

Główny Badacz jest odpowiedzialny za przechowywanie istotnych dokumentów badania przed, w trakcie i po zakończeniu lub zakończeniu badania, zgodnie z czasem wymaganym przez obowiązujące przepisy prawa i OWZ.

Dane gromadzone w CRF są ściśle anonimowe, a podmiot identyfikowany jest jedynie za pomocą numeru i inicjałów.

Badacz będzie musiał zachować oryginalne dane pacjenta i świadomą pisemną zgodę.

Inspekcje / Audyty

Jeżeli organ regulacyjny wymaga kontroli, badacz musi niezwłocznie poinformować o tym Komisję ds. Etyki.

Publikacja wyników

Wyniki eksperymentu zostaną opublikowane w ciągu dwunastu miesięcy od zakończenia.