Immunüberwachung nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation

Studienendpunkte

Der primäre Endpunkt der Studie ist der Nachweis zirkulierender Zellen durch Durchflusszytometrie vor und nach allogener Stammzelltransplantation. Wir analysieren folgende Zellen: Myeloide Dendritische Zellen, Plasmazytoide Dendritische Zellen, CD16+ Dendritische Zellen, CD14+ Monozyten, CD14+/CD16+ Monozyten, Gesamt-T-Lymphozyten, Gesamt-T-Helfer-Lymphozyten, zentrales Gedächtnis, naiv, Effektor-Gedächtnis und Effektor-T-Helfer-Lymphozyten, Gesamtzytotoxizität Lymphozyten, zentrales Gedächtnis, naiv, Effektor-Gedächtnis und zytotoxische Effektor-T-Lymphozyten, CD16+/CD56+-NK-Zellen, B-Lymphozyten, regulatorische T-Lymphozyten.

Die sekundären Endpunkte sind:

• Bestimmung der Serumkonzentration von Zytokinen (TNFα, IFNγ, IL-4) und Chemokinen (MIP- und MCP-Gruppe).
• Bestimmung von Autoantikörpern im Serum. In der ersten Phase wird eine Screening-Analyse durchgeführt, indem nach Anti-Nuklear-Antikörpern (ANA) und Anti-ENA-Antikörpern (Extractable Nuclear Antigens) gesucht wird. Positive Ergebnisse werden einer Second-Level-Analyse unterzogen. Als nächstes fahren wir mit der Analyse verschiedener organspezifischer Autoantikörper fort, die zuvor mit chronischer GVHD in Verbindung gebracht wurden, wie Leberantikörper (SMA, AMA, SLA), Anti-Cardiolipin- und Beta2-Mikroglobulin-Antikörper, Antikörper gegen Schilddrüsen- und Magenbelegzellen.
• Untersuchung der Expression von CD86-, CXCR4-, CCR2-, CCR5-, CD11a- und CD49d-Molekülen in Monozyten und dendritischen Zellen.
• Untersuchung der TNF- und IL-12-Produktion durch gereinigte Monozyten
• Untersuchung der allostimulatorischen Aktivität von gereinigten Monozyten gegen allogene CD4+ T-Zellen.
• Untersuchung der Antigenerfassung und -verarbeitung durch Phagozytose, Makropinozytose und Endozytose, vermittelt durch gereinigte Monozytenrezeptoren.
• Untersuchung der Expression von CD134 (0X40L), CD154 (CD40L)-Molekülen, Untersuchung von Differenzierungsmolekülen Typ 1 und Typ 2 T-Helferzellen und assoziierter regulatorischer T-Zellen, Untersuchung von Molekülen, die mit Zelltod assoziiert sind.
• Untersuchung der Proliferation und Produktion von Zytokinen (einschließlich IL-2, IL-5, IFNγ und IL-10) und Freisetzung von Perforin und Granzym nach Stimulation mit Mitogenen.
• Untersuchung der Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Antwort durch Pentamere zum Nachweis von HY-Antigen durch ELISPOT-Assay. Die Zellen des Empfängers werden vor der Transplantation gesammelt und gelagert
• PCR-Untersuchung von Mikro(mi)-RNA in Patientenserum und -zellen.
• PCR- und Microarray-Untersuchung des Genexpressionsprofils von transplantierten Monozyten

Studiendesign

Prospektive Einzelzentrums-Beobachtungsstudie unter Verwendung von menschlichem Gewebe für In-vitro-Studien nach allogener Stammzelltransplantation. Die Studie beinhaltet eine retrospektive Phase. Die Studie erfordert, dass periphere Blutproben des Patienten entnommen werden:

• beim Betreten der Abteilung
• nach 1 Monat Transplantation
• nach 3, 6, 9, 12 Monaten Transplantation

Studienpopulation

Alle Patienten, die sich in unserem Institut einer allogenen Transplantation unterziehen, sind eingeschlossen.

Entnahme und Verarbeitung von Blutproben

Jede periphere Blutprobe muss in drei Heparinröhrchen (bis zu 18 ml SP) und einem nicht gerinnungsfreien Röhrchen (6 ml für insgesamt mindestens 3 ml Serum) entnommen werden.

Jede Probe wird wie folgt verarbeitet:

Blutproben, die ohne Antikoagulans entnommen wurden, werden zur Gewinnung von Serum zentrifugiert, die Serumaliquots werden eingefroren und bei -20 °C gelagert. Die immunphänotypische Analyse auf Anzahl und Funktion der genannten Zellen wird an frischen PB-Proben innerhalb von 72 Stunden nach der Entnahme durchgeführt.

Mononukleäre Zellen und Monozyten werden durch Standardverfahren gereinigt (MNCs durch Dichtegradientenzentrifugation, Monozyten durch immunmagnetische Selektion) und dann in flüssigem Stickstoff gelagert, bis sie für erwartete funktionelle Assays verwendet werden. Die negative CD14-Fraktion wird eingefroren und als Quelle für T-Lymphozyten verwendet.

Durchflusszytometrische Analyse

Die Anzahl und der Phänotyp der im Immunsystem zirkulierenden Zellen werden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der spezifischen monoklonalen Antikörper bestimmt. Wir betrachten die folgenden Immunzellen:

• CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten, einschließlich naiver T-Lymphozyten (CD45RA + CCR7 +), „Effektor“-Gedächtnis-Lymphozyten (CD45RA-CCR7-), „zentraler“ Gedächtnis-Lymphozyten (CD45RA-CCR7 +) und Effektor-Lymphozyten (CD45RA-CCR7 +).
• T regulatorische Lymphozyten (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• B-Lymphozyten (CD19+)
• NK-Zellen (CD56 + CD16-) und zytotoxische (CD56 + CD16 +) Zellen.
• Myeloide dendritische Zellen CD11c + (Linie-, DR+, CD33+), plasmazytoide dendritische Zellen (Linie-, DR+, CD33- und CD123+) und monozytoide (CD33+, CD14-, CD16+) DCs.
• Entzündliche (CD14 + CD16 +) und Bestandteile (CD14 + CD16-) Monozyten

Funktionsstudien an gereinigten Monozyten

• Die Produktion von TNF alpha und IL12 wird durchflusszytometrisch gemessen.
• Die allostimulatorische Funktion wird in gemischten Leukozytenkulturen unter Verwendung von HLA-verschiedenen CD4+-T-Lymphozyten als "Responder" bestimmt.
• Die Fähigkeit, Antigene einzufangen, wird in der Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen durch Fluoreszenzantigene, wie FITC-konjugiertes Albumin oder fluoreszierende Kügelchen, gemessen.
• Das Genexpressionsprofil wird mit einer MICROARRAY-Studie erstellt

Funktionsstudien an gereinigten T-Lymphozyten

• Die Expression von Aktivierungs-, Differenzierungs- und Apoptosemolekülen wird durch Zytometrie bestimmt
• Die Zytokinproduktion wird in der Einfarben-Durchflusszytometrie nach Stimulation mit Anti-CD3 und Anti-CD28 bestimmt.
• Bei positiven männlichen HLA-A2-Patienten, die eine weibliche Spendertransplantation erhalten, wird die Häufigkeit von T-Anti-HY-Lymphozyten durch Fluorochrom-konjugierte Pentamere gemessen.
• Bei allen anderen Patienten wird die Antwort des T-Zell-Spenders auf Rezeptorantigene in ELISPOT gemessen.

Studie zu Serumzytokinen

Die Konzentration von Serumzytokinen wird in der Zytometrie unter Verwendung von CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA) bestimmt. Wir analysieren die folgenden Zytokine:

• T-Helfer-1-Zytokine: TNF-alpha, IFN-gamma und IL-12;
• T-Helfer 2 und regulatorische Zytokine (IL-10, IL-5) und TGF-beta
• Chemokine: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alpha und MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Serum-Autoantikörper-Studie

Die Konzentration der antinukleären Antikörper wird durch indirekte Immunfluoreszenz an HEp2-Zellen (einer Zelllinie des Leberkarzinoms) gemessen. Die Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) werden mittels ELISA (ENA SCREENING) gemessen. Im Falle einer Positivität wird das Vorhandensein von Antikörpern gegen spezifische Antigene durch DOT BLOT bestimmt.

Mikro(mi)-RNA-PCR-Studie im Serum und in den Zellen des Patienten

Die Gesamt-RNA wird aus menschlichen Serumproben extrahiert und bei -80 °C gelagert. Ein Teil der RNA (3 µl) wird für die reverse Transkription und Präamplifikation mit einem Pool von Primern gemäß der Beschreibung des Herstellers verarbeitet. 664 humane miRNA, 6 kleine humane RNA und 1 Kontroll-miRNA werden parallel prozessiert.

Genexpressionsprofil Untersuchung von Monozyten von transplantierten Patienten durch PCR und MICROARRAY

Der Monozyten-RNA-Boten wird aus den Zellen extrahiert, durch reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt und gleichzeitig mit einer fluoreszierenden Sonde markiert. Die Hybridisierung zwischen den auf der Matrix vorhandenen Nukleinsäuren (Sonden) und dem cDNA-Target bleibt hybridisiert und kann dann durch Nachweis der Bindungsstelle identifiziert werden. Am Ende der Studie werden alle Proben vernichtet.

Begleitbehandlungen

Die Patienten erhalten oder haben eine Chemotherapie zur Transplantationsvorbereitung gemäß der aktuellen klinischen Praxis erhalten. Nach der Transplantation erhalten die Patienten Medikamente zur Prophylaxe von GVHD und Infektionen gemäß der klinischen Praxis. Begleittherapien, die gemäß der klinischen Praxis möglicherweise durchgeführt werden, werden in CRF dokumentiert.

Besuchs- und Bewertungsplan

Ein Patientenbesuch wird erwartet und CNI wird bei der Einschreibung ausgefüllt. Es gibt 6 Blutproben pro Patient. Jede Blutentnahme nach der Einschreibung kann um 14 Tage verzögert oder vorweggenommen werden

Labortests

Die Tests werden im Rahmen des normalen Versorgungspfads durchgeführt und sind nicht studienspezifisch. Informationen zu Blutuntersuchungen werden auf CRFs gemeldet.

statistische Analyse

Der primäre Endpunkt der Studie ist die Messung der Anzahl zirkulierender Immunzellen in PB vor und nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Die statistische Analyse besteht aus einer Vergleichsanalyse zwischen Durchschnittswerten unter Verwendung des Programms GRAPH PAD PRISM Version 4.02. Das Signifikanzniveau ist definiert als < 0,05. Die Analyse der sekundären Endpunkte wird mit den gleichen Methoden durchgeführt.

Probengröße

Die Studie wird allen Patienten vorgeschlagen, die sich einer allogenen Transplantation unterziehen. Die Anzahl der im Institut Seràgnoli durchgeführten Transplantationen liegt im Durchschnitt zwischen 50 und 60 pro Jahr. Es wird daher geschätzt, dass 300 Patienten in die Studie aufgenommen werden.

Verwaltungsverfahren

Jede Änderung des Protokolls erfolgt in Form der Änderung. Während des Studienzeitraums sind keine anderen Arten von Änderungen am Protokoll zulässig. Alle unerwarteten Änderungen in der Studie werden im klinischen Studienbericht festgehalten.

Verwaltung der informierten Zustimmung

Alle Patienten datieren und schreiben die Einverständniserklärung innerhalb eines der Besuche, die durch den normalen Pflegepfad vorgesehen sind. Bei verstorbenen Patienten gilt die Datenverarbeitung als genehmigt mit Genehmigung der Studie durch die Ethikkommission gemäß allgemeiner Genehmigung (Amtsblatt 72 vom 26.03.2012)

Dokumentationsarchiv

Der Hauptprüfarzt ist für die Aufbewahrung der wesentlichen Studienunterlagen vor, während und nach Abschluss oder Beendigung der Studie gemäß der von den geltenden Gesetzen und GCPs vorgeschriebenen Zeit verantwortlich.

Die im CRF gesammelten Daten sind streng anonym und die Person wird nur mit einer Nummer und Initialen identifiziert.

Der Prüfarzt muss die Originaldaten des Patienten und die informierte schriftliche Einwilligung aufbewahren.

Inspektionen / Audits

Verlangt eine Aufsichtsbehörde eine Inspektion, muss der Prüfer unverzüglich die Ethikkommission informieren.

Veröffentlichung der Ergebnisse

Die Ergebnisse des Experiments werden innerhalb von zwölf Monaten nach Abschluss veröffentlicht.