Monitoraggio immunitario dopo trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche

Endpoint dello studio

L'endpoint primario dello studio è il rilevamento delle cellule circolanti mediante citometria a flusso prima e dopo il trapianto di cellule staminali allogeniche. Analizziamo le seguenti cellule: cellule dendritiche mieloidi, cellule dendritiche plasmacitoidi, cellule dendritiche CD16+, monociti CD14+, monociti CD14+/CD16+, linfociti T totali, linfociti T helper totali, memoria centrale, naive, memoria effettrice e linfociti T helper effettrici, citotossici totali linfociti, memoria centrale, naive, memoria effettrice e linfociti T citotossici effettori, cellule NK CD16+/CD56+, linfociti B, linfociti T regolatori.

Gli endpoint secondari sono:

• Determinazione della concentrazione sierica di Citochine (TNFα, IFNγ, IL-4) e Chemochine (gruppo MIP e MCP).
• Determinazione degli autoanticorpi nel siero. Nella prima fase viene eseguita l'analisi di screening ricercando anticorpi antinucleo (ANA) e anticorpi anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). I risultati positivi sono sottoposti ad analisi di secondo livello. Successivamente, si procede all'analisi di diversi autoanticorpi organo-specifici, precedentemente associati a GVHD cronica, come anticorpi epatici (SMA, AMA, SLA), anticorpi anti-cardiolipina e beta2 microglobulina, anticorpi contro le cellule tiroidee e parietali gastriche.
• Studio dell'espressione delle molecole CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a e CD49d in monociti e cellule dendritiche.
• Studio della produzione di TNF e IL-12 da parte di monociti purificati
• Studio dell'attività allostimolante di monociti purificati contro cellule T CD4+ allogeniche.
• Studio della cattura e del processamento dell'antigene mediante fagocitosi, macropinocitosi ed endocitosi mediate da recettori di monociti purificati.
• Studio dell'espressione delle molecole CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), studio delle molecole di differenziamento delle cellule T helper di tipo 1 e di tipo 2 e delle cellule T regolatorie associate, studio delle molecole associate alla morte cellulare.
• Studio della proliferazione e produzione di citochine (tra cui IL-2, IL-5, IFNγ e IL-10) e del rilascio di perforina e granzima dopo stimolazione con mitogeni.
• Studio della risposta dei linfociti T antigene-specifici da parte dei pentameri per il rilevamento dell'antigene HY mediante saggio ELISPOT. Le cellule del ricevente vengono raccolte e conservate prima del trapianto
• Studio PCR del micro (mi) RNA nel siero e nelle cellule del paziente.
• Studio PCR e Microarray del profilo di espressione genica di monociti trapiantati

Progettazione dello studio

Studio prospettico osservazionale in un singolo centro che utilizza tessuti umani per lo studio in vitro dopo trapianto di cellule staminali allogeniche. Lo studio prevede una fase retrospettiva. Lo studio richiede che i campioni di sangue periferico del paziente vengano raccolti:

• entrando in reparto
• dopo 1 mese dal trapianto
• dopo 3, 6, 9,12 mesi dal trapianto

Popolazione di studio

Sono inclusi tutti i pazienti sottoposti a Trapianto Allogenico nel nostro Istituto.

Raccolta e trattamento dei campioni di sangue

Ogni campione di sangue periferico deve essere raccolto in tre provette con eparina (fino a 18 ml di SP) e una provetta non anticoagulante (6 ml per un totale di almeno 3 ml di siero)

Ogni campione viene elaborato come segue:

Il campione di sangue prelevato senza anticoagulante verrà centrifugato per ottenere il siero, le aliquote di siero vengono congelate e conservate a -20°C. Le analisi immunofenotipiche per numero e funzione delle suddette cellule vengono eseguite su campioni freschi di PB entro 72 ore dal prelievo.

Le cellule mononucleate e i monociti vengono purificati mediante procedure standard (MNC mediante centrifugazione in gradiente di densità, monociti mediante selezione immunomagnetica) e quindi conservati in azoto liquido fino a quando non vengono utilizzati per i saggi funzionali previsti. La frazione CD14 negativa viene congelata e utilizzata come fonte di linfociti T.

Analisi di citometria a flusso

Il numero e il fenotipo delle cellule circolanti del sistema immunitario sono determinati mediante citometria a flusso utilizzando gli specifici anticorpi monoclonali. Si considerano le seguenti cellule immunitarie:

• Linfociti T CD4+ e CD8+ inclusi linfociti T naïve (CD45RA + CCR7 +) linfociti memoria "effettori" (CD45RA-CCR7-), linfociti memoria "centrali" (CD45RA-CCR7 +) e linfociti effettori (CD45RA-CCR7 +).
• Linfociti T regolatori (CD4+CD25+CD127-FoxP3+).
• Linfociti B (CD19 +)
• Cellule NK (CD56 + CD16-) e cellule citotossiche (CD56 + CD16 +).
• Cellule dendritiche mieloidi CD11c + (lignaggio-, DR +, CD33 +), cellule dendritiche plasmacitoidi (lignaggio-, DR +, CD33- e CD123 +) e DC monocitoidi (CD33 +, CD14-, CD16 +).
• Monociti infiammatori (CD14 + CD16 +) e costituenti (CD14 + CD16-)

Studi funzionali su monociti purificati

• La produzione di TNF alfa e IL12 viene misurata in citometria a flusso.
• La funzione allostimolante viene determinata in colture miste di leucociti utilizzando diversi linfociti T CD4 + HLA come "responder".
• La capacità di catturare gli antigeni viene misurata in citometria a flusso su singole cellule mediante antigeni di fluorescenza, come l'albumina coniugata con FITC o perline fluorescenti.
• Il profilo di espressione genica viene eseguito utilizzando uno studio MICROARRAY

Studi funzionali su linfociti T purificati

• L'espressione delle molecole di attivazione, differenziamento e apoptosi è determinata mediante citometria
• La produzione di citochine è determinata in citometria a flusso a colore singolo dopo stimolazione con anti-CD3 e anti-CD28.
• Nei pazienti maschi HLA-A2 positivi sottoposti a trapianto da donatore femmina, la frequenza dei linfociti T anti-HY viene misurata mediante pentameri coniugati con fluorocromo.
• In tutti gli altri pazienti, la risposta del donatore di cellule T agli antigeni del recettore viene misurata in ELISPOT.

Studio delle citochine sieriche

La concentrazione di citochine sieriche è determinata in citometria utilizzando CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Analizziamo le seguenti citochine:

• Citochine T-helper 1: TNF-alfa, IFN-gamma e IL-12;
• T-helper 2 e citochine regolatrici (IL-10, IL-5) e TGF-beta
• Chemochine: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa e MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Studio sugli autoanticorpi sierici

La concentrazione degli anticorpi antinucleari viene misurata mediante immunofluorescenza indiretta su cellule HEp2 (una linea cellulare di epatocarcinoma). Gli anticorpi contro gli antigeni nucleari estraibili (ENA) sono misurati mediante ELISA (ENA SCREENING). In caso di positività, la presenza di anticorpi contro antigeni specifici viene determinata mediante DOT BLOT.

studio di micro(mi) RNA PCR nel siero e nelle cellule del paziente

L'RNA totale viene estratto da campioni di siero umano e conservato a -80°C. Una parte di RNA (3µl) viene processata per la trascrizione inversa e la pre-amplificazione con un pool di primer secondo la descrizione del fornitore. 664 miRNA umani, 6 piccoli RNA umani e 1 miRNA di controllo vengono processati in parallelo.

Profilo di espressione genica Studio di monociti di pazienti trapiantati mediante PCR e MICROARRAY

L'RNA messaggero monocitario viene estratto dalle cellule, convertito in cDNA dalla trascrittasi inversa e contemporaneamente marcato con una sonda fluorescente. L'ibridazione tra gli acidi nucleici (sonde) presenti sulla matrice e il bersaglio del cDNA rimarrà ibridata e potrà quindi essere identificata rilevando la posizione in cui è legata. Alla fine dello studio, tutti i campioni saranno distrutti.

Trattamenti concomitanti

I pazienti riceveranno o hanno ricevuto chemioterapia per la preparazione al trapianto secondo l'attuale pratica clinica. Dopo il trapianto, i pazienti riceveranno farmaci per la profilassi della GVHD e delle infezioni secondo la pratica clinica. Le terapie concomitanti eventualmente somministrate secondo la pratica clinica sono documentate in CRF.

Calendario delle visite e delle valutazioni

È prevista la visita del paziente e il CRF è completato al momento dell'arruolamento. Sono disponibili 6 campioni di sangue per paziente. Eventuali prelievi di sangue successivi all'arruolamento possono essere posticipati o anticipati di 14 giorni

Test di laboratorio

I test vengono eseguiti nell'ambito del normale percorso di cura e non sono specifici dello studio. Le informazioni sugli esami del sangue sono riportate sui CRF.

analisi statistica

L'endpoint primario dello studio è la misura del numero di cellule immunitarie circolanti nel PB prima e dopo il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche. L'analisi statistica consiste nell'analisi comparativa tra le medie utilizzando il programma GRAPH PAD PRISM versione 4.02. Il livello di significatività è definito come <.05 L'analisi degli endpoint secondari viene eseguita utilizzando gli stessi metodi.

Misura di prova

Lo studio è proposto a tutti i pazienti sottoposti a trapianto allogenico. Il numero di trapianti eseguiti presso l'Istituto Seràgnoli è in media tra i 50 ei 60 all'anno. Si stima pertanto che 300 pazienti saranno arruolati nello studio.

Procedure amministrative

Qualsiasi modifica al protocollo sarà apportata sotto forma di emendamento. Non sono consentiti altri tipi di modifiche al protocollo durante il periodo di studio. Eventuali cambiamenti imprevisti nello studio saranno registrati nel rapporto dello studio clinico.

Gestione del consenso informato

Tutti i pazienti datano e scrivono il Consenso Informato all'interno di una delle visite previste dal normale percorso assistenziale. Per i pazienti deceduti si ritiene che il trattamento dei dati sia autorizzato con l'approvazione dello studio da parte del Comitato Etico, secondo autorizzazione generale (Gazzetta Ufficiale 72 del 26/03/2012)

Archivio documentazione

Il ricercatore principale è responsabile della conservazione dei documenti essenziali dello studio prima, durante e dopo il completamento o la conclusione dello studio, in conformità con il tempo richiesto dalle leggi e dalle GCP applicabili.

I dati raccolti nel CRF sono rigorosamente anonimi e il soggetto viene identificato solo con un numero e una sigla.

Lo Sperimentatore dovrà conservare i dati originali del paziente e il consenso scritto informato.

Ispezioni / Audit

Se un'autorità di regolamentazione richiede un'ispezione, l'investigatore deve informare immediatamente il comitato etico.

Pubblicazione dei risultati

I risultati dell'esperimento saranno pubblicati entro dodici mesi dalla conclusione.