Monitoramento Imunológico Após Transplante Alogênico de Células Tronco Hematopoiéticas

Pontos finais do estudo

O objetivo primário do estudo é a detecção de células circulantes por citometria de fluxo antes e depois do transplante de células-tronco alogênicas. Analisamos as seguintes células: Células dendríticas mielóides, células dendríticas plasmocitóides, células dendríticas CD16+, monócitos CD14+, monócitos CD14+/CD16+, linfócitos T totais, linfócitos T auxiliares totais, memória central, virgens, memória efetora e linfócitos T auxiliares efetores, citotóxicos totais linfócitos, memória central, ingênuos, memória efetora e linfócitos citotóxicos T efetores, células NK CD16+/CD56+, linfócitos B, linfócitos T regulatórios.

Os endpoints secundários são:

• Determinação da concentração sérica de Citocinas (TNFα, IFNγ, IL-4) e Quimiocinas (grupo MIP e MCP).
• Determinação de autoanticorpos no soro. Na primeira fase, a análise de triagem é realizada pela pesquisa de anticorpos antinucleares (ANA) e anticorpos anti-ENA (Antígenos Nucleares Extraíveis). Os resultados positivos são submetidos a uma análise de segundo nível. Em seguida, procedemos à análise de diferentes autoanticorpos específicos de órgãos, previamente associados à DECH crônica, como anticorpos hepáticos (SMA, AMA, SLA), anticorpos anticardiolipina e microglobulina beta2, anticorpos contra células parietais da tireóide e gástricas.
• Estudo da expressão das moléculas CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a e CD49d em Monócitos e Células Dendríticas.
• Estudo da produção de TNF e IL-12 por monócitos purificados
• Estudo da atividade aloestimuladora de monócitos purificados contra células T CD4+ alogênicas.
• Estudo da captura e processamento de antígenos por fagocitose, macropinocitose e endocitose mediada por receptores de monócitos purificados.
• Estudo da expressão de moléculas CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), estudo de moléculas de diferenciação tipo 1 e tipo 2 T helper cells e T reguladoras associadas, estudo de moléculas de Morte Celular associadas.
• Estudo da proliferação e produção de citocinas (incluindo IL-2, IL-5, IFNγ e IL-10) e liberação de perforina e granzima após estimulação com mitógenos.
• Estudo da resposta de linfócitos T antígeno-específicos por pentâmeros para detecção do antígeno HY pelo ensaio ELISPOT. As células do receptor são coletadas e armazenadas antes do transplante
• Estudo de PCR de micro (mi) RNA no soro e nas células do paciente.
• Estudo por PCR e Microarray do perfil de expressão gênica de monócitos transplantados

Design de estudo

Estudo observacional prospectivo de centro único empregando tecidos humanos para estudo in vitro após transplante alogênico de células-tronco. O estudo inclui uma fase retrospectiva. O estudo requer que as amostras de sangue periférico do paciente sejam colhidas:

• ao entrar no departamento
• após 1 mês do transplante
• após 3, 6, 9,12 meses de transplante

População do estudo

Todos os pacientes submetidos a transplante alogênico em nosso Instituto estão incluídos.

Coleta e processamento de amostras de sangue

Cada amostra de sangue periférico deve ser coletada em três tubos de heparina (até 18 ml de SP) e um tubo de não anticoagulante (6 ml para um total de pelo menos 3 ml de soro)

Cada amostra é processada da seguinte forma:

Amostra de sangue coletada sem anticoagulante será centrifugada para obtenção de soro, as alíquotas de soro são congeladas e armazenadas a -20°C. As análises imunofenotípicas para número e função das células mencionadas são realizadas em amostras frescas de PB em até 72 horas após a coleta.

Células mononucleares e monócitos são purificados por procedimentos padrão (MNCs por centrifugação de gradiente de densidade, monócitos por seleção imunomagnética) e então armazenados em nitrogênio líquido até serem usados ​​para ensaios funcionais esperados. A fração CD14 negativa é congelada e utilizada como fonte de linfócitos T.

Análise de citometria de fluxo

O número e o fenótipo das células circulantes do sistema imunológico são determinados por citometria de fluxo usando os anticorpos monoclonais específicos. São consideradas as seguintes células imunes:

• Linfócitos T CD4+ e CD8+ incluindo linfócitos T virgens (CD45RA + CCR7+) linfócitos de memória "efetores" (CD45RA-CCR7-), linfócitos de memória "centrais" (CD45RA-CCR7+) e linfócitos efetores (CD45RA-CCR7+).
• Linfócitos T reguladores (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• Linfócitos B (CD19+)
• Células NK (CD56 + CD16-) e células citotóxicas (CD56 + CD16 +).
• DCs de Células Dendríticas Mielóides CD11c+ (linhagem-, DR+, CD33+), Células Dendríticas Plasmacitoides (linhagem-, DR+, CD33- e CD123+) e Monocitóides (CD33+, CD14-, CD16+).
• Monócitos Inflamatórios (CD14 + CD16 +) e Constituintes (CD14 + CD16-)

Estudos funcionais em monócitos purificados

• A produção de TNF alfa e IL12 é medida em citometria de fluxo.
• A função aloestimuladora é determinada em culturas mistas de leucócitos usando diferentes linfócitos T CD4+ HLA como "responsivos".
• A capacidade de capturar antígenos é medida em citometria de fluxo em células individuais por antígenos de fluorescência, como albumina conjugada com FITC ou grânulos fluorescentes.
• O perfil de expressão gênica é realizado usando um estudo MICROARRAY

Estudos funcionais em linfócitos T purificados

• A expressão de moléculas de ativação, diferenciação e apoptose é determinada por citometria
• A produção de citocinas é determinada em citometria de fluxo de cor única após estimulação com anti-CD3 e anti-CD28.
• Em pacientes masculinos HLA-A2 positivos recebendo transplante de doador feminino, a frequência de linfócitos T anti-HY é medida por pentâmeros conjugados com fluorocromo.
• Em todos os outros pacientes, a resposta do doador de células T aos antígenos do receptor é medida no ELISPOT.

Estudo de citocinas séricas

A concentração de citocinas séricas é determinada em citometria usando CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, EUA). Analisamos as seguintes citocinas:

• Citocinas T-helper 1: TNF-alfa, IFN-gama e IL-12;
• T-helper 2 e citocinas reguladoras (IL-10, IL-5) e TGF-beta
• Quimiocinas: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa e MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Estudo de autoanticorpos séricos

A concentração dos anticorpos antinucleares é medida por imunofluorescência indireta em células HEp2 (uma linha celular de hepatocarcinoma). Os anticorpos contra antígenos nucleares extraíveis (ENA) são medidos por ELISA (ENA SCREENING). Em caso de positividade, a presença de anticorpos contra antígenos específicos é determinada por DOT BLOT.

micro(mi) estudo de PCR de RNA no soro e células do paciente

O RNA total é extraído de amostras de soro humano e armazenado a -80°C. Uma parte do RNA (3µl) é processada para transcrição reversa e pré-amplificação com um pool de primers conforme descrição do fornecedor. 664 miRNA humanos, 6 pequenos RNA humanos e 1 miRNA de controle são processados ​​em paralelo.

Perfil de expressão gênica Estudo de monócitos de pacientes transplantados por PCR e MICROARRAY

O monócito RNA mensageiro é extraído das células, convertido em cDNA pela transcriptase reversa e ao mesmo tempo marcado com uma sonda fluorescente. A hibridização entre os ácidos nucléicos (sondas) presentes na matriz e o cDNA alvo permanecerá hibridizada e poderá então ser identificada pela detecção do local onde está ligada. No final do estudo, todas as amostras serão destruídas.

Tratamentos concomitantes

Os pacientes receberão ou receberam quimioterapia para preparação para transplante de acordo com a prática clínica atual. Após o transplante, os pacientes receberão medicação para profilaxia de GVHD e infecções de acordo com a prática clínica. As terapias concomitantes possivelmente administradas de acordo com a prática clínica estão documentadas no CRF.

Agendamento de visitas e avaliações

A visita do paciente é esperada e o CRF é preenchido na inscrição. Existem 6 amostras de sangue por paciente. Qualquer amostra de sangue após a inscrição pode ser adiada ou antecipada em 14 dias

Testes laboratoriais

Os testes são realizados sob a via de cuidados normais e não são específicos do estudo. As informações dos exames de sangue são informadas nos CRFs.

Análise estatística

O endpoint primário do estudo é a medida do número de células imunes circulantes em PB antes e depois do transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. A análise estatística consiste na análise de comparação entre médias utilizando o programa GRAPH PAD PRISM versão 4.02. O nível de significância é definido como <0,05. A análise dos endpoints secundários é realizada usando os mesmos métodos.

Tamanho da amostra

O estudo é proposto a todos os pacientes submetidos a transplante alogênico. O número de transplantes realizados no Instituto Seràgnoli é em média entre 50 e 60 por ano. Portanto, estima-se que 300 pacientes serão incluídos no estudo.

Procedimentos administrativos

Qualquer modificação no protocolo será feita na forma da emenda. Nenhum outro tipo de modificação no protocolo é permitido durante o período do estudo. Quaisquer alterações inesperadas no estudo serão registradas no Relatório de Estudo Clínico.

Gestão do consentimento informado

Todos os pacientes datam e escrevem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido em uma das consultas fornecidas pelo percurso normal de atendimento. Para doentes falecidos, considera-se que o tratamento dos dados é autorizado com a aprovação do estudo pela Comissão de Ética, conforme autorização geral (Diário Oficial 72 de 26/03/2012)

arquivo de documentação

O Investigador principal é responsável pelo armazenamento dos documentos essenciais do estudo antes, durante e após a conclusão ou término do estudo, de acordo com o tempo exigido pelas leis e GCPs aplicáveis.

Os dados coletados no CRF são estritamente anônimos e o sujeito é identificado apenas com um número e iniciais.

O Investigador terá que manter os dados originais do paciente e o consentimento informado por escrito.

Inspeções / Auditorias

Se uma Autoridade Reguladora exigir uma inspeção, o Investigador deve informar imediatamente o Comitê de Ética.

Publicação de resultados

Os resultados do experimento serão publicados dentro de doze meses após a conclusão.