Immunövervakning efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Studera slutpunkter

Studiens primära effektmått är detektion av cirkulerande celler genom flödescytometri före och efter allogen stamcellstransplantation. Vi analyserar följande celler: Myeloid dendritiska celler, Plasmacytoida dendritiska celler, CD16+ dendritiska celler, CD14+ monocyter, CD14+/CD16+ monocyter, totala T-lymfocyter, totala T-hjälparlymfocyter, centralminne, naivt, effektorminne och effektor T-hjälparlymfocyter, totala cytotoxiska lymfocyter lymfocyter, centralt minne, naivt, effektorminne och effektor T cytotoxiska lymfocyter, CD16+/CD56+ NK-celler, B-lymfocyter, T-regulatoriska lymfocyter.

De sekundära slutpunkterna är:

• Bestämning av serumkoncentrationen av cytokiner (TNFα, IFNγ, IL-4) och kemokiner (MIP- och MCP-grupp).
• Bestämning av autoantikroppar i serum. I den första fasen görs screeninganalys genom att söka efter antinukleära antikroppar (ANA) och antikroppar anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Positiva resultat utsätts för analys på andra nivån. Därefter går vi vidare till analysen av olika organspecifika autoantikroppar, tidigare associerade med kronisk GVHD, som leverantikroppar (SMA, AMA, SLA), anti-kardiolipin- och beta2-mikroglobulinantikroppar, antikroppar mot sköldkörtel- och magparietalceller.
• Studie av uttryck av CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a och CD49d molekyler i monocyter och dendritiska celler.
• Studie av TNF- och IL-12-produktion av renade monocyter
• Studie av allostimulerande aktivitet av renade monocyter mot Allogena CD4+ T-celler.
• Studie av antigeninfångning och bearbetning av fagocytos, makropinocytos och endocytos medierad av renade monocyter receptorer.
• Studie av CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) molekylers uttryck, studie av differentieringsmolekyler typ 1 och typ 2 T-hjälparceller och T-regulatoriska celler associerade, studie av molekyler associerade med celldöd.
• Studie av cytokinproliferation och produktion (inklusive IL-2, IL-5, IFNy och IL-10) och frisättning av perforin och granzym efter stimulering med mitogener.
• Studie av antigenspecifika T-lymfocyters svar av pentamerer för detektion av HY-antigen med ELISPOT-analys. Mottagarens celler samlas in och lagras före transplantationen
• PCR-studie av mikro (mi) RNA i patientens serum och celler.
• PCR och Microarray-studie av genuttrycksprofil för transplanterade monocyter

Studera design

Observationell prospektiv studie med ett enda centrum som använder mänskliga vävnader för in vitro-studie efter allogen stamcellstransplantation. Studien innehåller en retrospektiv fas. Studien kräver att patientens perifera blodprover skördas:

• vid inträde på avdelningen
• efter 1 månads transplantation
• efter 3, 6, 9,12 månaders transplantation

Studera befolkning

Alla patienter som genomgår allogen transplantation i vårt institut ingår.

Insamling och bearbetning av blodprover

Varje perifert blodprov måste samlas i tre heparinrör (upp till 18 ml SP) och ett icke-antikoagulerande rör (6 ml för totalt minst 3 ml serum)

Varje prov bearbetas enligt följande:

Blodprov som tagits utan antikoaguleringsmedel kommer att centrifugeras för att erhålla serum, alikvoterna av serum fryses och förvaras vid -20°C. Den immunfenotypiska analysen för antal och funktion av de nämnda cellerna utförs på färska PB-prover inom 72 timmar efter insamling.

Mononukleära celler och monocyter renas med standardförfaranden (MNC genom densitetsgradientcentrifugering, monocyter genom immunomagnetiskt urval) och lagras sedan i flytande kväve tills de används för förväntade funktionella analyser. Den negativa CD14-fraktionen fryses och används som källa för T-lymfocyter.

Flödescytometrianalys

Antalet och fenotypen av immunsystemets cirkulerande celler bestäms genom flödescytometri med användning av de specifika monoklonala antikropparna. Vi anses vara följande immunceller:

• CD4+ och CD8+ T-lymfocyter inklusive T-naiva lymfocyter (CD45RA + CCR7+), "effektor"-minneslymfocyter (CD45RA-CCR7-), "centrala" minneslymfocyter (CD45RA-CCR7+) och effektorlymfocyter (CD45RA-CCR7+).
• T-regulatoriska lymfocyter (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3+).
• B-lymfocyter (CD19+)
• NK-celler (CD56 + CD16-) och cytotoxiska (CD56 + CD16+) celler.
• Myeloida dendritiska celler CD11c+ (härstamning-, DR+, CD33+), Plasmacytoida dendritiska celler (härstamnings-, DR+, CD33- och CD123+) och Monocytoida (CD33+, CD14-, CD16+) DCs.
• Inflammatoriska (CD14 + CD16 +) och beståndsdelar (CD14 + CD16-) monocyter

Funktionsstudier på renade monocyter

• TNF-alfa- och IL12-produktion mäts i flödescytometri.
• Den allostimulerande funktionen bestäms i blandade leukocytkulturer med användning av HLA olika CD4 + T-lymfocyter som "svarare".
• Förmågan att fånga antigener mäts i flödescytometri på enskilda celler med fluorescensantigener, såsom FITC-konjugerat albumin eller fluorescerande pärlor.
• Genuttrycksprofilen utförs med hjälp av en MICROARRAY-studie

Funktionsstudier på renade T-lymfocyter

• Uttrycket av aktiverings-, differentierings- och apoptosmolekyler bestäms av cytometri
• Cytokinproduktionen bestäms i enfärgsflödescytometri efter stimulering med anti-CD3 och anti-CD28.
• Hos positiva manliga HLA-A2-patienter som får kvinnlig donatortransplantation mäts frekvensen av T-anti-HY-lymfocyter med fluorokromkonjugerade pentamerer.
• Hos alla andra patienter mäts T-cellsdonatorns svar på receptorantigener i ELISPOT.

Studie av serumcytokiner

Koncentrationen av serumcytokiner bestäms i cytometri med användning av CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Vi analyserar följande cytokiner:

• T-hjälpar 1-cytokiner: TNF-alfa, IFN-gamma och IL-12;
• T-hjälpare 2 och regulatorer cytokiner (IL-10, IL-5) och TGF-beta
• Kemokiner: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa och MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Studie av autoantikroppar i serum

Koncentrationen av de antinukleära antikropparna mäts genom indirekt immunfluorescens på HEp2-celler (en cellinje av hepatokarcinom). Antikropparna mot extraherbara nukleära antigener (ENA) mäts med ELISA (ENA SCREENING). Vid positivitet bestäms närvaron av antikroppar mot specifika antigener med DOT BLOT.

mikro(mi) RNA PCR-studie i patientens serum och celler

Det totala RNA:t extraheras från humana serumprover och lagras vid -80 °C. En del av RNA (3 µl) bearbetas för omvänd transkription och pre-amplifiering med en pool av primers enligt leverantörens beskrivning. 664 humant miRNA, 6 små humant RNA och 1 kontrollmiRNA bearbetas parallellt.

Genuttrycksprofil Studie av transplanterade patienters monocyter med PCR och MICROARRAY

Monocyt-RNA-budbäraren extraheras från cellerna, omvandlas till cDNA genom omvänt transkriptas och märks samtidigt med en fluorescerande sond. Hybridiseringen mellan nukleinsyrorna (proberna) som finns på matrisen och cDNA-målet kommer att förbli hybridiserad och kan sedan identifieras genom att detektera platsen där den är bunden. I slutet av studien kommer alla prover att förstöras.

Samtidiga behandlingar

Patienter kommer att få eller ha fått kemoterapi för transplantationsförberedelse enligt gällande klinisk praxis. Efter transplantation kommer patienter att få medicin för profylax av GVHD och infektioner enligt klinisk praxis. Samtidiga terapier som eventuellt administreras enligt klinisk praxis dokumenteras i CRF.

Schema för besök och utvärderingar

Patientbesök förväntas och CRF avslutas vid inskrivningen. Det finns 6 blodprover per patient. Alla blodprover efter inskrivningen kan försenas eller förutses med 14 dagar

Laboratorietester

Tester utförs under den normala vårdvägen och är inte studiespecifika. Blodundersökningsinformation rapporteras på CRF.

Statistisk analys

Studiens primära effektmått är måttet på antalet cirkulerande immunceller i PB före och efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation. Statistisk analys består av jämförelseanalys mellan medelvärden med hjälp av programmet GRAPH PAD PRISM version 4.02. Signifikansnivån definieras som <.05. Analys av sekundära endpoints utförs med samma metoder.

Provstorlek

Studien föreslås till alla patienter som genomgår allogen transplantation. Antalet transplantationer som utförs vid Seràgnoli-institutet är i genomsnitt mellan 50 och 60 per år. Det beräknas därför att 300 patienter kommer att inkluderas i studien.

Administrativa förfaranden

Alla ändringar av protokollet kommer att göras i form av ändringen. Inga andra typer av modifieringar av protokollet är tillåtna under studieperioden. Alla oväntade förändringar i studien kommer att registreras i den kliniska studierapporten.

Hantering av informerat samtycke

Alla patienter daterar och skriver det informerade samtycket inom ett av de besök som den normala vårdvägen ger. För döda patienter anses att databehandlingen är godkänd med godkännande av studien av etikkommittén, enligt allmän auktorisation (Oftlig tidning 72 av 2012-03-26)

Dokumentationsarkiv

Huvudutredaren är ansvarig för att lagra de väsentliga dokumenten i studien före, under och efter slutförandet eller avslutande av studien, i enlighet med den tid som krävs av tillämpliga lagar och GCP.

Uppgifterna som samlas in i CRF är strikt anonyma och ämnet identifieras endast med ett nummer och initialer.

Utredaren måste behålla patientens originaldata och informerade skriftliga samtycke.

Inspektioner/revisioner

Om en tillsynsmyndighet kräver en inspektion, måste utredaren omedelbart informera den etiska kommittén.

Publicering av resultat

Resultaten av experimentet kommer att publiceras inom tolv månader efter slutsatsen.