异基因造血干细胞移植后的免疫监测

研究终点

研究的主要终点是在同种异体干细胞移植前后通过流式细胞术检测循环细胞。 我们分析以下细胞：髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD16+ 树突细胞、CD14+ 单核细胞、CD14+/CD16+ 单核细胞、总 T 淋巴细胞、总 T 辅助淋巴细胞、中央记忆细胞、幼稚细胞、效应记忆和效应 T 辅助淋巴细胞、总细胞毒性细胞淋巴细胞、中央记忆、幼稚、效应记忆和效应 T 细胞毒性淋巴细胞、CD16+/CD56+ NK 细胞、B 淋巴细胞、T 调节淋巴细胞。

次要终点是：

• 测定细胞因子（TNFα、IFNγ、IL-4）和趋化因子（MIP 和 MCP 组）的血清浓度。
• 血清中自身抗体的测定。 在第一阶段，通过搜索抗核抗体 (ANA) 和抗 ENA 抗体（Extractable Nuclear Antigens）进行筛选分析。 对阳性结果进行二级分析。 接下来，我们将继续分析以前与慢性 GVHD 相关的不同器官特异性自身抗体，如肝抗体（SMA、AMA、SLA）、抗心磷脂和 β2 微球蛋白抗体、针对甲状腺和胃壁细胞的抗体。
• 单核细胞和树突状细胞中CD86、CXCR4、CCR2、CCR5、CD11a和CD49d分子表达的研究。
• 纯化单核​​细胞产生 TNF 和 IL-12 的研究
• 纯化单核​​细胞对同种异体 CD4+ T 细胞的同种异体刺激活性研究。
• 通过纯化的单核细胞受体介导的吞噬作用、巨胞饮作用和内吞作用来捕获和处理抗原的研究。
• 研究CD134（0X40L）、CD154（CD40L）分子表达，研究分化分子type1和type 2 T helper cells and T regulatory Cells associated，研究分子Cellular Death associated。
• 细胞因子增殖和产生（包括 IL-2、IL-5、IFNγ 和 IL-10）以及有丝分裂原刺激后穿孔素和颗粒酶释放的研究。
• 通过 ELISPOT 法检测 HY 抗原的五聚体抗原特异性 T 淋巴细胞反应研究。 接受者的细胞在移植前被收集和储存
• 患者血清和细胞中微小 (mi) RNA 的 PCR 研究。
• 移植单核细胞基因表达谱的PCR和微阵列研究

学习规划

同种异体干细胞移植后采用人体组织进行体外研究的观察性单中心前瞻性研究。 该研究包括一个回顾阶段。 该研究要求采集患者的外周血样本：

• 在进入部门
• 移植1个月后
• 移植3、6、9、12个月后

研究人群

所有在我们研究所接受同种异体移植的患者都包括在内。

血液样本的采集和处理

每个外周血样本必须收集在三个肝素管（最多 18 毫升 SP）和一个非抗凝剂管（6 毫升，总共至少 3 毫升血清）

每个样品处理如下：

将不含抗凝剂的血样离心以获得血清，血清的等分试样冷冻并储存在-20℃。在采集后72小时内对新鲜PB样品进行上述细胞的数量和功能的免疫表型分析。

单核细胞和单核细胞通过标准程序纯化（MNCs 通过密度梯度离心，单核细胞通过免疫磁性选择），然后储存在液氮中，直到它们用于预期的功能测定。 将阴性 CD14 部分冷冻并用作 T 淋巴细胞的来源。

流式细胞术分析

免疫系统循环细胞的数量和表型使用特异性单克隆抗体通过流式细胞仪测定。我们被认为是以下免疫细胞：

• CD4+ 和 CD8+ T 淋巴细胞，包括幼稚 T 淋巴细胞 (CD45RA + CCR7 +)“效应”记忆淋巴细胞 (CD45RA-CCR7-)、“中心”记忆淋巴细胞 (CD45RA-CCR7 +) 和效应淋巴细胞 (CD45RA-CCR7 +)。
• T 调节淋巴细胞 (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +)。
• B 淋巴细胞 (CD19 +)
• NK 细胞 (CD56 + CD16-) 和细胞毒性 (CD56 + CD16 +) 细胞。
• 髓样树突细胞 CD11c +（谱系-、DR +、CD33 +）、浆细胞样树突细胞（谱系-、DR +、CD33- 和 CD123 +）和单核细胞样（CD33 +、CD14-、CD16 +）DC。
• 炎性 (CD14 + CD16 +) 和成分 (CD14 + CD16-) 单核细胞

纯化单核​​细胞的功能研究

• 在流式细胞术中测量 TNF α 和 IL12 的产生。
• 使用 HLA 不同的 CD4 + T 淋巴细胞作为“应答者”，在混合白细胞培养物中确定同种异体刺激功能。
• 捕获抗原的能力是在流式细胞术中通过荧光抗原（如 FITC 结合白蛋白或荧光珠）在单个细胞上测量的。
• 基因表达谱是使用 MICROARRAY 研究进行的

纯化 T 淋巴细胞的功能研究

• 细胞计数法测定活化、分化和凋亡分子的表达
• 在用抗 CD3 和抗 CD28 刺激后，在单色流式细胞仪中测定细胞因子的产生。
• 在接受女性供体移植的阳性男性 HLA-A2 患者中，T 抗 HY 淋巴细胞的频率通过荧光染料偶联的五聚体测量。
• 在所有其他患者中，T 细胞供体对受体抗原的反应在 ELISPOT 中测量。

血清细胞因子研究

使用 CBA（Cytokine Bead Assay，CBA，Becton Dickinson，Mountian View，CA，USA）在细胞计数中测定血清细胞因子的浓度。 我们分析了以下细胞因子：

• T 辅助 1 细胞因子：TNF-α、IFN-γ 和 IL-12；
• T 辅助细胞 2 和调节因子细胞因子（IL-10、IL-5）和 TGF-β
• 趋化因子：MCP1、MCP2、RANTES、MIP1-alpha 和 MIP1-beta； IL-8、IP-10。

血清自身抗体研究

抗核抗体的浓度通过对 HEp2 细胞（肝癌细胞系）的间接免疫荧光法测量。 通过 ELISA（ENA 筛选）测量针对可提取核抗原 (ENA) 的抗体。 在阳性的情况下，通过 DOT BLOT 确定是否存在针对特定抗原的抗体。

患者血清和细胞中的 micro(mi) RNA PCR 研究

从人血清样本中提取总 RNA，并在-80°C 下保存。根据供应商的描述，使用引物库对一部分 RNA (3µl) 进行逆转录和预扩增。 并行处理 664 个人类 miRNA、6 个人类小 RNA 和 1 个对照 miRNA。

通过 PCR 和 MICROARRAY 研究移植患者单核细胞的基因表达谱

从细胞中提取单核细胞RNA信使，通过逆转录酶转化为cDNA，同时用荧光探针标记。 存在于基质上的核酸（探针）与 cDNA 靶标之间的杂交将保持杂交状态，然后可以通过检测其结合的位置来识别。 在研究结束时，所有样本都将被销毁。

伴随治疗

根据目前的临床实践，患者将接受或已经接受化疗以进行移植准备。 移植后，患者将根据临床实践接受药物治疗以预防 GVHD 和感染。 CRF 中记录了可能根据临床实践进行的伴随治疗。

访问和评估时间表

患者访问是预期的，CRF 在登记时完成。 每个患者有 6 个血样。 入组后的任何血样都可以延迟或提前 14 天

实验室测试

测试是在正常护理途径下进行的，不是特定于研究的。 血液检查信息在 CRF 上报告。

统计分析

该研究的主要终点是异基因造血干细胞移植前后 PB 中循环免疫细胞数量的测量。 统计分析包括使用 GRAPH PAD PRISM 4.02 版程序对平均值进行比较分析。 显着性水平定义为 <.05 次要终点分析使用相同的方法进行。

样本量

该研究适用于所有接受同种异体移植的患者。 Seràgnoli 研究所每年平均进行 50 至 60 例移植手术。 因此，估计将有 300 名患者参加该研究。

行政手续

对协议的任何修改都将以修正案的形式进行。 在研究期间不允许对协议进行其他类型的修改。 研究中的任何意外变化都将记录在临床研究报告中。

知情同意的管理

所有患者在正常护理路径提供的一次访问中注明日期并签署知情同意书。 对于死亡患者，根据一般授权（官方期刊 26/03/2012，第 72 期），伦理委员会批准研究被认为是授权数据处理

文档存档

根据适用法律和 GCP 要求的时间，主要研究者负责在研究完成或终止之前、期间和之后存储研究的基本文件。

CRF 中收集的数据是严格匿名的，并且仅使用数字和首字母来标识主题。

调查员必须保留患者的原始数据和知情的书面同意书。

检查/审计

如果监管机构要求进行检查，调查员必须立即通知伦理委员会。

结果公布

实验结果将在得出结论后十二个月内公布。