Immunovervågning efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation

Undersøgelses endepunkter

Studiets primære endepunkt er påvisning af cirkulerende celler ved flowcytometri før og efter allogen stamcelletransplantation. Vi analyserer følgende celler: Myeloid dendritiske celler, Plasmacytoid dendritiske celler, CD16+ dendritiske celler, CD14+ monocytter, CD14+/CD16+ monocytter, totale T-lymfocytter, totale T-hjælperlymfocytter, central hukommelse, naiv, effektorhukommelse og effektor T-hjælperlymfocytter, total cytotoksiske lymfocytter, central hukommelse, naiv, effektorhukommelse og effektor T cytotoksiske lymfocytter, CD16+/CD56+ NK-celler, B-lymfocytter, T-regulatoriske lymfocytter.

De sekundære endepunkter er:

• Bestemmelse af serumkoncentrationen af ​​cytokiner (TNFα, IFNγ, IL-4) og kemokiner (MIP og MCP gruppe).
• Bestemmelse af autoantistoffer i serum. I den første fase udføres screeningsanalyse ved at søge efter antinukleære antistoffer (ANA) og antistoffer anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Positive resultater udsættes for analyse på andet niveau. Dernæst går vi videre til analysen af ​​forskellige organspecifikke autoantistoffer, tidligere forbundet med kronisk GVHD, som leverantistoffer (SMA, AMA, SLA), anti-cardiolipin og beta2 mikroglobulin antistoffer, antistoffer mod skjoldbruskkirtel og maveparietalceller.
• Undersøgelse af CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a og CD49d molekylers ekspression i monocytter og dendritiske celler.
• Undersøgelse af TNF og IL-12 produktion af oprensede monocytter
• Undersøgelse af allostimulerende aktivitet af oprensede monocytter mod Allogene CD4+ T-celler.
• Undersøgelse af antigenindfangning og -behandling ved fagocytose, makropinocytose og endocytose medieret af oprensede monocytter-receptorer.
• Undersøgelse af CD134 (0X40L), CD154 (CD40L) molekylers ekspression, undersøgelse af differentieringsmolekyler type1 og type 2 T-hjælperceller og T regulatoriske celler associerede, undersøgelse af molekyler Cellulær død associeret.
• Undersøgelse af proliferation og produktion af cytokiner (inklusive IL-2, IL-5, IFNγ og IL-10) og frigivelse af perforin og granzym efter stimulering med mitogener.
• Undersøgelse af antigenspecifik T-lymfocyt-respons af pentamerer til påvisning af HY-antigen ved ELISPOT-assay. Recipientens celler opsamles og opbevares før transplantationen
• PCR-undersøgelse af mikro (mi) RNA i patientens serum og celler.
• PCR og Microarray undersøgelse af genekspressionsprofil af transplanterede monocytter

Studere design

Observationel enkeltcenter prospektiv undersøgelse, der anvender humant væv til in vitro undersøgelse efter allogen stamcelletransplantation. Undersøgelsen omfatter en retrospektiv fase. Undersøgelsen kræver, at patientens perifere blodprøver høstes:

• ved indgangen til afdelingen
• efter 1 måneds transplantation
• efter 3, 6, 9,12 måneders transplantation

Studiebefolkning

Alle patienter, der gennemgår allogen transplantation i vores institut, er inkluderet.

Indsamling og behandling af blodprøver

Hver perifer blodprøve skal opsamles i tre heparinrør (op til 18 ml SP) og et ikke-antikoagulerende rør (6 ml for i alt mindst 3 ml serum)

Hver prøve behandles som følger:

Blodprøver taget uden antikoagulant vil blive centrifugeret for at opnå serum, alikvoterne af serum fryses og opbevares ved -20°C. Den immunfænotypiske analyse for antal og funktion af de nævnte celler udføres på friske PB-prøver inden for 72 timer efter indsamling.

Mononukleære celler og monocytter oprenses ved standardprocedurer (MNC'er ved tæthedsgradientcentrifugering, monocytter ved immunomagnetisk selektion) og opbevares derefter i flydende nitrogen, indtil de bruges til forventede funktionelle analyser. Den negative CD14-fraktion fryses og anvendes som kilden til T-lymfocytter.

Flowcytometrianalyse

Antallet og fænotypen af ​​immunsystemets cirkulerende celler bestemmes ved flowcytometri ved hjælp af de specifikke monoklonale antistoffer. Vi betragtes som følgende immunceller:

• CD4+ og CD8+ T-lymfocytter inklusive T-naive lymfocytter (CD45RA + CCR7+), "effektor"-hukommelseslymfocytter (CD45RA-CCR7-), "centrale" hukommelseslymfocytter (CD45RA-CCR7+) og effektorlymfocytter (CD45RA-CCR7+).
• T-regulatoriske lymfocytter (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3+).
• B-lymfocytter (CD19+)
• NK-celler (CD56 + CD16-) og cytotoksiske (CD56 + CD16+) celler.
• Myeloide dendritiske celler CD11c+ (slægts-, DR+, CD33+), Plasmacytoide dendritiske celler (slægts-, DR+, CD33- og CD123+) og Monocytoide (CD33+, CD14-, CD16+) DCs.
• Inflammatoriske (CD14 + CD16 +) og bestanddele (CD14 + CD16-) monocytter

Funktionelle undersøgelser af oprensede monocytter

• TNF alfa- og IL12-produktion måles i flowcytometri.
• Den allostimulerende funktion bestemmes i blandede leukocytkulturer under anvendelse af HLA forskellige CD4+ T-lymfocytter som "respondere".
• Evnen til at fange antigener måles i flowcytometri på individuelle celler ved hjælp af fluorescensantigener, såsom FITC-konjugeret albumin eller fluorescerende perler.
• Genekspressionsprofilen udføres ved hjælp af en MICROARRAY undersøgelse

Funktionelle undersøgelser af oprensede T-lymfocytter

• Ekspressionen af ​​aktiverings-, differentierings- og apoptosemolekyler bestemmes ved cytometri
• Cytokinproduktion bestemmes i enkeltfarvet flowcytometri efter stimulering med anti-CD3 og anti-CD28.
• Hos positive mandlige HLA-A2-patienter, der modtager kvindelig donortransplantation, måles frekvensen af ​​T-anti-HY-lymfocytter med fluorokrom-konjugerede pentamerer.
• Hos alle andre patienter måles T-celledonorrespons på receptorantigener i ELISPOT.

Serum cytokiner undersøgelse

Koncentrationen af ​​serumcytokiner bestemmes ved cytometri under anvendelse af CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Vi analyserer følgende cytokiner:

• T-hjælper 1 cytokiner: TNF-alfa, IFN-gamma og IL-12;
• T-hjælper 2 og regulatorer cytokiner (IL-10, IL-5) og TGF-beta
• Kemokiner: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa og MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Serum autoantistoffer undersøgelse

Koncentrationen af ​​de antinukleære antistoffer måles ved indirekte immunfluorescens på HEp2-celler (en cellelinje af hepatokarcinom). Antistofferne mod ekstraherbare nukleare antigener (ENA) måles ved ELISA (ENA SCREENING). I tilfælde af positivitet bestemmes tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod specifikke antigener ved DOT BLOT.

mikro(mi) RNA PCR undersøgelse i patientens serum og celler

Det totale RNA ekstraheres fra humane serumprøver og opbevares ved -80 °C. En del af RNA (3 µl) behandles til revers transkription og præ-amplifikation med en pool af primere i henhold til leverandørens beskrivelse. 664 humane miRNA, 6 små humane RNA og 1 kontrol miRNA behandles parallelt.

Genekspressionsprofil Undersøgelse af transplanterede patients monocytter ved PCR og MICROARRAY

Monocyt-RNA-budbringeren ekstraheres fra cellerne, omdannes til cDNA ved revers transkriptase og mærkes samtidig med en fluorescerende probe. Hybridiseringen mellem nukleinsyrerne (proberne), der er til stede på matrixen, og cDNA-målet vil forblive hybridiseret og kan derefter identificeres ved at detektere det sted, hvor det er bundet. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen vil alle prøver blive destrueret.

Samtidige behandlinger

Patienter vil modtage eller have modtaget kemoterapi til transplantationsforberedelse i henhold til gældende klinisk praksis. Efter transplantation vil patienter modtage medicin til profylakse af GVHD og infektioner i henhold til klinisk praksis. Samtidig behandling, der eventuelt administreres i henhold til klinisk praksis, er dokumenteret i CRF.

Tidsplan for besøg og evalueringer

Patientbesøg forventes og CRF afsluttes ved indskrivningen. Der er 6 blodprøver pr. patient. Enhver blodprøve efter tilmeldingen kan forsinkes eller forventes med 14 dage

Laboratorieundersøgelser

Tests udføres under den normale behandlingsvej og er ikke undersøgelsesspecifikke. Blodundersøgelsesoplysninger rapporteres på CRF'er.

Statistisk analyse

Studiets primære endepunkt er målingen af ​​antallet af cirkulerende immunceller i PB før og efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Statistisk analyse består af sammenligningsanalyse mellem gennemsnit ved hjælp af programmet GRAPH PAD PRISM version 4.02. Signifikansniveauet er defineret som <,05 Analyse af sekundære endepunkter udføres ved brug af de samme metoder.

Prøvestørrelse

Studiet foreslås til alle patienter, der gennemgår allogen transplantation. Antallet af transplantationer udført på Seràgnoli Instituttet er i gennemsnit mellem 50 og 60 om året. Det anslås derfor, at 300 patienter vil blive optaget i undersøgelsen.

Administrative procedurer

Enhver ændring af protokollen vil blive foretaget i form af ændringen. Ingen andre typer ændringer af protokollen er tilladt i løbet af undersøgelsesperioden. Eventuelle uventede ændringer i undersøgelsen vil blive registreret i den kliniske undersøgelsesrapport.

Håndtering af informeret samtykke

Alle patienter daterer og skriver det informerede samtykke inden for et af de besøg, som den normale plejevej giver. For døde patienter anses det for, at databehandlingen er godkendt med godkendelse af undersøgelsen af ​​den etiske komité, i henhold til generel autorisation (EFT 72 af 26/03/2012)

Dokumentationsarkiv

Den primære investigator er ansvarlig for at opbevare de væsentlige dokumenter i undersøgelsen før, under og efter afslutningen eller afslutningen af ​​undersøgelsen i overensstemmelse med den tid, der kræves af gældende love og GCP'er.

De data, der indsamles i CRF, er strengt anonyme, og emnet er kun identificeret med et nummer og initialer.

Efterforskeren skal opbevare patientens originale data og informerede skriftlige samtykke.

Inspektioner/revisioner

Hvis en tilsynsmyndighed kræver en inspektion, skal efterforskeren straks informere den etiske komité.

Offentliggørelse af resultater

Resultaterne af eksperimentet vil blive offentliggjort inden for tolv måneder efter konklusionen.