Monitoreo inmunológico después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Criterios de valoración del estudio

El criterio principal de valoración del estudio es la detección de células circulantes mediante citometría de flujo antes y después del trasplante alogénico de células madre. Analizamos las siguientes células: Células dendríticas mieloides, Células dendríticas plasmocitoides, Células dendríticas CD16+, Monocitos CD14+, Monocitos CD14+/CD16+, Linfocitos T totales, Linfocitos T auxiliares totales, memoria central, naive, memoria efectora y linfocitos T auxiliares efectores, citotóxicos totales linfocitos, memoria central, naive, memoria efectora y linfocitos T citotóxicos efectores, células NK CD16+/CD56+, linfocitos B, linfocitos T reguladores.

Los criterios de valoración secundarios son:

• Determinación de la concentración sérica de Citocinas (TNFα, IFNγ, IL-4) y Quimiocinas (grupo MIP y MCP).
• Determinación de autoanticuerpos en el suero. En la primera fase, se realiza un análisis de cribado mediante la búsqueda de anticuerpos antinucleares (ANA) y anticuerpos anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Los resultados positivos se someten a análisis de segundo nivel. A continuación, se procede al análisis de diferentes Autoanticuerpos Organoespecíficos, previamente asociados a la EICH crónica, como anticuerpos hepáticos (SMA, AMA, SLA), anticuerpos anti-cardiolipina y microglobulina beta2, Anticuerpos contra tiroides y células parietales gástricas.
• Estudio de la expresión de moléculas CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a y CD49d en Monocitos y Células Dendríticas.
• Estudio de producción de TNF e IL-12 por monocitos purificados
• Estudio de la actividad aloestimuladora de monocitos purificados frente a linfocitos T CD4+ alogénicos.
• Estudio de la captura y procesamiento de antígenos por fagocitosis, macropinocitosis y endocitosis mediada por receptores de monocitos purificados.
• Estudio de expresión de moléculas CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), estudio de moléculas de diferenciación tipo 1 y tipo 2 Células T helper y Células T reguladoras asociadas, estudio de moléculas Muerte Celular asociada.
• Estudio de proliferación y producción de Citoquinas (incluyendo IL-2, IL-5, IFNγ e IL-10) y liberación de perforina y granzima tras estimulación con mitógenos.
• Estudio de respuesta de linfocitos T antígeno-específicos mediante pentámeros para detección de antígeno HY mediante ensayo ELISPOT. Las células del receptor se recolectan y almacenan antes del trasplante.
• Estudio PCR de micro (mi) RNA en suero y células del paciente.
• Estudio PCR y Microarray del perfil de expresión génica de monocitos trasplantados

Diseño del estudio

Estudio prospectivo observacional de un solo centro que emplea tejidos humanos para el estudio in vitro después del trasplante alogénico de células madre. El estudio incluye una fase retrospectiva. El estudio requiere que las muestras de sangre periférica del paciente se recolecten:

• al entrar al departamento
• después de 1 mes del trasplante
• después de 3, 6, 9,12 meses del trasplante

Población de estudio

Se incluyen todos los pacientes sometidos a Trasplante Alogénico en nuestro Instituto.

Recolección y procesamiento de muestras de sangre.

Cada muestra de sangre periférica debe recogerse en tres tubos de heparina (hasta 18 ml de SP) y un tubo sin anticoagulante (6 ml para un total de al menos 3 ml de suero)

Cada muestra se procesa de la siguiente manera:

La muestra de sangre tomada sin anticoagulante se centrifugará para obtener suero, las alícuotas de suero se congelarán y almacenarán a -20°C. Los análisis inmunofenotípicos de número y función de las células mencionadas se realizarán en muestras frescas de PB dentro de las 72 horas posteriores a la recolección.

Las células mononucleares y los monocitos se purifican mediante procedimientos estándar (CMN mediante centrifugación en gradiente de densidad, monocitos mediante selección inmunomagnética) y luego se almacenan en nitrógeno líquido hasta que se utilizan para los ensayos funcionales esperados. La fracción CD14 negativa se congela y se utiliza como fuente de linfocitos T.

Análisis de citometría de flujo

El número y el fenotipo de las células circulantes del sistema inmunitario se determinan mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos monoclonales específicos. Se consideran células inmunitarias las siguientes:

• Linfocitos T CD4+ y CD8+, incluidos los linfocitos T vírgenes (CD45RA+CCR7+), los linfocitos de memoria “efectores” (CD45RA-CCR7-), los linfocitos de memoria “centrales” (CD45RA-CCR7+) y los linfocitos efectores (CD45RA-CCR7+).
• Linfocitos T reguladores (CD4+CD25+CD127-FoxP3+).
• Linfocitos B (CD19+)
• Células NK (CD56+CD16-) y células citotóxicas (CD56+CD16+).
• Células dendríticas mieloides CD11c+ (linaje-, DR+, CD33+), células dendríticas plasmocitoides (linaje-, DR+, CD33- y CD123+) y CD monocitoides (CD33+, CD14-, CD16+).
• Monocitos Inflamatorios (CD14+CD16+) y Constituyentes (CD14+CD16-)

Estudios funcionales en monocitos purificados

• La producción de TNF alfa e IL12 se mide en citometría de flujo.
• La función aloestimuladora se determina en cultivos mixtos de leucocitos utilizando linfocitos T CD4+ HLA diferentes como “respondedores”.
• La capacidad de capturar antígenos se mide en citometría de flujo en células individuales mediante antígenos de fluorescencia, como albúmina conjugada con FITC o perlas fluorescentes.
• El perfil de expresión génica se realiza mediante un estudio MICROARRAY

Estudios funcionales sobre linfocitos T purificados

• La expresión de moléculas de activación, diferenciación y apoptosis se determina mediante citometría
• La producción de citoquinas se determina en citometría de flujo de un solo color después de la estimulación con anti-CD3 y anti-CD28.
• En pacientes masculinos HLA-A2 positivos que reciben un trasplante de donante femenino, la frecuencia de linfocitos T anti-HY se mide mediante pentámeros conjugados con fluorocromo.
• En todos los demás pacientes, la respuesta del donante de células T a los antígenos del receptor se mide en ELISPOT.

Estudio de citocinas séricas

La concentración de citoquinas séricas se determina en citometría usando CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, EE. UU.). Analizamos las siguientes citoquinas:

• Citoquinas T-helper 1: TNF-alfa, IFN-gamma e IL-12;
• T-helper 2 y reguladores de citocinas (IL-10, IL-5) y TGF-beta
• Quimiocinas: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alfa y MIP1-beta; IL-8, IP-10.

Estudio de autoanticuerpos séricos

La concentración de anticuerpos antinucleares se mide por inmunofluorescencia indirecta en células HEp2 (una línea celular de hepatocarcinoma). Los anticuerpos contra antígenos nucleares extraíbles (ENA) se miden por ELISA (ENA SCREENING). En caso de positividad, se determina la presencia de anticuerpos contra antígenos específicos mediante DOT BLOT.

estudio micro(mi) RNA PCR en suero y células del paciente

El ARN total se extrae de muestras de suero humano y se almacena a -80 °C. Una parte del ARN (3 µl) se procesa para transcripción inversa y preamplificación con un conjunto de cebadores según la descripción del proveedor. Se procesan en paralelo 664 miARN humanos, 6 ARN humanos pequeños y 1 miARN de control.

Perfil de expresión génica Estudio de monocitos de pacientes trasplantados por PCR y MICROARRAY

El mensajero de ARN de monocitos se extrae de las células, se convierte en ADNc mediante transcriptasa inversa y al mismo tiempo se marca con una sonda fluorescente. La hibridación entre los ácidos nucleicos (sondas) presentes en la matriz y la diana de cDNA permanecerá hibridada y luego podrá identificarse detectando la ubicación a la que se une. Al final del estudio, todas las muestras serán destruidas.

Tratamientos concomitantes

Los pacientes recibirán o habrán recibido quimioterapia para la preparación del trasplante de acuerdo con la práctica clínica actual. Después del trasplante, los pacientes recibirán medicación para la profilaxis de la EICH y las infecciones según la práctica clínica. Las terapias concomitantes posiblemente administradas de acuerdo con la práctica clínica están documentadas en CRF.

Calendario de visitas y evaluaciones

Se espera la visita del paciente y el CRF se completa en el momento de la inscripción. Hay 6 muestras de sangre por paciente. Cualquier muestra de sangre después de la inscripción puede retrasarse o anticiparse 14 días.

Pruebas de laboratorio

Las pruebas se realizan bajo la vía de atención normal y no son específicas del estudio. La información del examen de sangre se informa en los CRF.

análisis estadístico

El criterio principal de valoración del estudio es la medida del número de células inmunitarias circulantes en PB antes y después del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. El análisis estadístico consiste en un análisis de comparación entre promedios utilizando el programa GRAPH PAD PRISM versión 4.02. El nivel de significancia se define como <.05 El análisis de los criterios de valoración secundarios se realiza utilizando los mismos métodos.

Tamaño de la muestra

El estudio se propone a todos los pacientes sometidos a trasplante alogénico. El número de trasplantes que se realizan en el Instituto Seràgnoli es de media entre 50 y 60 al año. Por lo tanto, se estima que 300 pacientes se inscribirán en el estudio.

Procedimientos administrativos

Cualquier modificación al protocolo se hará en forma de enmienda. No se permite ningún otro tipo de modificación del protocolo durante el período de estudio. Cualquier cambio inesperado en el estudio se registrará en el Informe del estudio clínico.

Gestión del consentimiento informado

Todos los pacientes fechan y escriben el Consentimiento Informado dentro de una de las visitas previstas por la ruta normal de atención. Para pacientes fallecidos, se considera que el tratamiento de datos está autorizado con la aprobación del estudio por el Comité de Ética, según autorización general (Diario Oficial 72 del 26/03/2012)

Archivo de documentación

El Investigador principal es responsable del almacenamiento de los documentos esenciales del estudio antes, durante y después de la finalización o terminación del estudio, de acuerdo con el tiempo requerido por las leyes aplicables y las BPC.

Los datos recogidos en el CRF son estrictamente anónimos y sólo se identifica al sujeto con un número e iniciales.

El Investigador deberá conservar los datos originales del paciente y el consentimiento informado por escrito.

Inspecciones / Auditorías

Si una Autoridad Reguladora requiere una inspección, el Investigador debe informar inmediatamente al Comité de Ética.

Publicación de resultados

Los resultados del experimento se publicarán dentro de los doce meses siguientes a su conclusión.