Иммунный мониторинг после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

Конечные точки исследования

Первичной конечной точкой исследования является обнаружение циркулирующих клеток с помощью проточной цитометрии до и после трансплантации аллогенных стволовых клеток. Мы анализируем следующие клетки: миелоидные дендритные клетки, плазмацитоидные дендритные клетки, CD16+ дендритные клетки, CD14+ моноциты, CD14+/CD16+ моноциты, общее количество Т-лимфоцитов, общее количество Т-хелперных лимфоцитов, центральную память, наивные, эффекторные клетки памяти и эффекторные Т-хелперные лимфоциты, общее цитотоксическое лимфоциты, центральная память, наивные, эффекторная память и эффекторные Т-цитотоксические лимфоциты, CD16+/CD56+ NK-клетки, В-лимфоциты, Т-регуляторные лимфоциты.

Вторичные конечные точки:

• Определение сывороточной концентрации цитокинов (TNFα, IFNγ, IL-4) и хемокинов (группы MIP и MCP).
• Определение аутоантител в сыворотке крови. На первом этапе проводится скрининговый анализ путем поиска антинуклеарных антител (ANA) и антител анти-ENA (Extractable Nuclear Antigens). Положительные результаты подвергаются анализу второго уровня. Далее мы переходим к анализу различных органоспецифических аутоантител, ранее связанных с хронической РТПХ, таких как антитела к печени (SMA, AMA, SLA), антитела к кардиолипину и бета2-микроглобулину, антитела к париетальным клеткам щитовидной железы и желудка.
• Изучение экспрессии молекул CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a и CD49d в моноцитах и ​​дендритных клетках.
• Исследование продукции TNF и IL-12 очищенными моноцитами
• Изучение аллостимулирующей активности очищенных моноцитов в отношении аллогенных CD4+ Т-клеток.
• Изучение захвата и процессинга антигена путем фагоцитоза, макропиноцитоза и эндоцитоза, опосредованного очищенными рецепторами моноцитов.
• Изучение экспрессии молекул CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), изучение молекул дифференцировки Т-хелперных клеток типа 1 и типа 2 и ассоциированных Т-регуляторных клеток, изучение молекул, ассоциированных с клеточной смертью.
• Изучение пролиферации и продукции цитокинов (включая IL-2, IL-5, IFNγ и IL-10) и высвобождения перфорина и гранзима после стимуляции митогенами.
• Изучение антигенспецифического ответа Т-лимфоцитов пентамерами на обнаружение HY-антигена методом ELISPOT. Клетки реципиента собираются и хранятся перед трансплантацией.
• ПЦР-исследование микро(ми)РНК в сыворотке и клетках больного.
• ПЦР и микрочиповое исследование профиля экспрессии генов трансплантированных моноцитов

Дизайн исследования

Обсервационное одноцентровое проспективное исследование с использованием тканей человека для изучения in vitro после аллогенной трансплантации стволовых клеток. Исследование включает ретроспективный этап. Исследование требует, чтобы образцы периферической крови пациента были собраны:

• при поступлении в отделение
• через 1 месяц после трансплантации
• через 3, 6, 9, 12 месяцев после трансплантации

Исследуемая популяция

Включены все пациенты, перенесшие аллогенную трансплантацию в нашем институте.

Сбор и обработка образцов крови

Каждый образец периферической крови должен быть собран в три пробирки с гепарином (до 18 мл SP) и пробирку с неантикоагулянтом (6 мл, всего не менее 3 мл сыворотки).

Каждый образец обрабатывается следующим образом:

Образец крови, взятый без антикоагулянта, центрифугируют для получения сыворотки, аликвоты сыворотки замораживают и хранят при -20°C. Иммунофенотипический анализ на количество и функцию указанных клеток проводят на свежих образцах PB в течение 72 часов после сбора.

Мононуклеарные клетки и моноциты очищают стандартными процедурами (МНК центрифугированием в градиенте плотности, моноциты методом иммуномагнитной селекции) и затем хранят в жидком азоте до тех пор, пока они не будут использованы для ожидаемых функциональных анализов. Отрицательную фракцию CD14 замораживают и используют в качестве источника Т-лимфоцитов.

Анализ проточной цитометрии

Количество и фенотип циркулирующих клеток иммунной системы определяют с помощью проточной цитометрии с использованием специфических моноклональных антител. Мы рассматриваем следующие иммунные клетки:

• CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты, включая Т-наивные лимфоциты (CD45RA+CCR7+), «эффекторные» лимфоциты памяти (CD45RA-CCR7-), «центральные» лимфоциты памяти (CD45RA-CCR7+) и эффекторные лимфоциты (CD45RA-CCR7+).
• Т-регуляторные лимфоциты (CD4+CD25+CD127-FoxP3+).
• В-лимфоциты (CD19+)
• NK-клетки (CD56+CD16-) и цитотоксические (CD56+CD16+) клетки.
• Миелоидные дендритные клетки CD11c+ (линия-, DR+, CD33+), плазмоцитоидные дендритные клетки (линия-, DR+, CD33- и CD123+) и моноцитоидные (CD33+, CD14-, CD16+) ДК.
• Воспалительные (CD14+CD16+) и составные (CD14+CD16-) моноциты

Функциональные исследования очищенных моноцитов

• Продукцию TNF-альфа и IL-12 измеряют с помощью проточной цитометрии.
• Аллостимулирующую функцию определяют в смешанных культурах лейкоцитов с использованием различных HLA CD4+ Т-лимфоцитов в качестве «респондеров».
• Способность захватывать антигены измеряют в проточной цитометрии на отдельных клетках с помощью флуоресцентных антигенов, таких как FITC-конъюгированный альбумин или флуоресцентные шарики.
• Профиль экспрессии генов выполняется с помощью исследования MICROARRAY.

Функциональные исследования очищенных Т-лимфоцитов

• Экспрессию молекул активации, дифференцировки и апоптоза определяют с помощью цитометрии.
• Продукцию цитокинов определяют с помощью одноцветной проточной цитометрии после стимуляции анти-CD3 и анти-CD28.
• У пациентов с положительным HLA-A2 мужского пола, получающих трансплантацию от донора женского пола, частоту Т-анти-HY-лимфоцитов измеряют с помощью пентамеров, конъюгированных с флуорохромом.
• У всех остальных пациентов Т-клеточный донорский ответ на рецепторные антигены измеряется в ELISPOT.

Исследование сывороточных цитокинов

Концентрацию цитокинов в сыворотке определяют цитометрически с использованием CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Мы анализируем следующие цитокины:

• цитокины Т-хелперов 1: TNF-альфа, IFN-гамма и IL-12;
• Т-хелпер 2 и регуляторы цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-5) и ТФР-бета
• хемокины: MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-альфа и MIP1-бета; Ил-8, ИП-10.

Исследование сывороточных аутоантител

Концентрацию антинуклеарных антител измеряют с помощью непрямой иммунофлуоресценции на клетках НЕр2 (клеточная линия гепатокарциномы). Антитела против экстрагируемых ядерных антигенов (ENA) измеряют с помощью ELISA (ENA SCREENING). В случае положительного результата определяют наличие антител против специфических антигенов с помощью ДОТ-БЛОТА.

исследование микро(ми) РНК ПЦР в сыворотке и клетках пациента

Тотальную РНК выделяют из образцов сыворотки крови человека и хранят при температуре -80°С. Часть РНК (3 мкл) подвергают обратной транскрипции и предварительной амплификации с использованием пула праймеров в соответствии с описанием поставщика. Параллельно процессируют 664 микроРНК человека, 6 малых РНК человека и 1 контрольную микроРНК.

Профиль экспрессии генов Исследование моноцитов трансплантированного пациента методами ПЦР и MICROARRAY

Из клеток выделяют моноцитарную РНК-мессенджер, превращают в кДНК с помощью обратной транскриптазы и одновременно метят флуоресцентным зондом. Гибридизация между нуклеиновыми кислотами (зондами), присутствующими на матрице, и кДНК-мишенью останется гибридизированной, и затем ее можно будет идентифицировать путем обнаружения места, где она связана. По окончании исследования все образцы будут уничтожены.

Сопутствующее лечение

Пациенты будут получать или получали химиотерапию для подготовки к трансплантации в соответствии с текущей клинической практикой. После трансплантации пациенты будут получать препараты для профилактики РТПХ и инфекций в соответствии с клинической практикой. Сопутствующая терапия, которая может применяться в соответствии с клинической практикой, задокументирована в CRF.

График посещений и оценок

Ожидается посещение пациента, и при регистрации заполняется ИРК. На одного пациента приходится 6 проб крови. Любая проба крови после регистрации может быть отложена или предвосхищена на 14 дней.

Лабораторные тесты

Тесты проводятся в соответствии с обычной схемой лечения и не являются специфическими для исследования. Информация об исследовании крови указывается в ИРК.

статистический анализ

Первичной конечной точкой исследования является измерение количества циркулирующих иммунных клеток в PB до и после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Статистический анализ состоит из сравнительного анализа средних значений с использованием программы GRAPH PAD PRISM версии 4.02. Уровень значимости определяется как <0,05. Анализ вторичных конечных точек выполняется с использованием тех же методов.

Размер образца

Исследование предлагается всем пациентам, перенесшим аллогенную трансплантацию. Количество трансплантаций, проводимых в Институте Сераньоли, составляет в среднем от 50 до 60 в год. Таким образом, предполагается, что в исследование будет включено 300 пациентов.

Административные процедуры

Любое изменение протокола будет сделано в виде поправки. Никакие другие модификации протокола не допускаются в течение периода исследования. Любые неожиданные изменения в исследовании будут зарегистрированы в отчете о клиническом исследовании.

Управление информированным согласием

Все пациенты назначают дату и записывают информированное согласие в рамках одного из посещений, предусмотренных обычной схемой лечения. Для умерших пациентов считается, что обработка данных разрешена с одобрения исследования Комитетом по этике, согласно общему разрешению (Официальный журнал 72 от 26.03.2012)

Архив документации

Главный исследователь несет ответственность за хранение основных документов исследования до, во время и после завершения или прекращения исследования в соответствии со сроками, требуемыми применимыми законами и GCP.

Данные, собранные в CRF, строго анонимны, а субъект идентифицируется только по номеру и инициалам.

Исследователь должен будет сохранить исходные данные пациента и информированное письменное согласие.

Инспекции/аудиты

Если регулирующий орган требует проведения проверки, исследователь должен немедленно сообщить об этом Комитету по этике.

Публикация результатов

Результаты эксперимента будут опубликованы в течение двенадцати месяцев после заключения.