Surveillance immunitaire après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

Critères d'évaluation de l'étude

Le critère d'évaluation principal de l'étude est la détection des cellules en circulation par cytométrie en flux avant et après la greffe de cellules souches allogéniques. Nous analysons les cellules suivantes : Cellules dendritiques myéloïdes, Cellules dendritiques plasmacytoïdes, Cellules dendritiques CD16+, Monocytes CD14+, Monocytes CD14+/CD16+, Lymphocytes T totaux, Lymphocytes T auxiliaires totaux, mémoire centrale, naïves, mémoire effectrice et lymphocytes T auxiliaires effecteurs, cytotoxiques totaux lymphocytes, mémoire centrale, lymphocytes naïfs, effecteurs mémoire et effecteurs T cytotoxiques, cellules NK CD16+/CD56+, lymphocytes B, lymphocytes T régulateurs.

Les critères secondaires sont :

• Détermination de la concentration sérique des Cytokines (TNFα, IFNγ, IL-4) et des Chimiokines (groupe MIP et MCP).
• Détermination des auto-anticorps dans le sérum. Dans une première phase, l'analyse de dépistage est réalisée par la recherche d'anticorps anti-nucléaires (ANA) et d'anticorps anti-ENA (Antigènes Nucléaires Extractibles). Les résultats positifs sont soumis à une analyse de second niveau. Ensuite, nous procédons à l'analyse de différents auto-anticorps spécifiques d'organes, précédemment associés à la GVHD chronique, comme les anticorps hépatiques (SMA, AMA, SLA), les anticorps anti-cardiolipine et bêta2 microglobuline, les anticorps contre les cellules pariétales thyroïdiennes et gastriques.
• Etude de l'expression des molécules CD86, CXCR4, CCR2, CCR5, CD11a et CD49d dans les monocytes et les cellules dendritiques.
• Etude de la production de TNF et d'IL-12 par des monocytes purifiés
• Etude de l'activité allostimulatrice des monocytes purifiés contre les lymphocytes T CD4+ allogéniques.
• Étude de la capture et de la transformation des antigènes par phagocytose, macropinocytose et endocytose médiées par des récepteurs monocytes purifiés.
• Etude de l'expression des molécules CD134 (0X40L), CD154 (CD40L), étude des molécules de différenciation des cellules T helper type1 et type 2 et des Cellules T régulatrices associées, étude des molécules associées à la Mort Cellulaire.
• Étude de la prolifération et de la production de cytokines (dont IL-2, IL-5, IFNγ et IL-10) et de la libération de perforine et de granzyme après stimulation par des mitogènes.
• Etude de la réponse des lymphocytes T spécifiques de l'antigène par les pentamères pour la détection de l'antigène HY par dosage ELISPOT. Les cellules du receveur sont collectées et stockées avant la greffe
• Étude PCR de micro (mi) ARN dans le sérum et les cellules du patient.
• Étude PCR et Microarray du profil d'expression génique des monocytes transplantés

Étudier le design

Étude prospective observationnelle monocentrique utilisant des tissus humains pour une étude in vitro après une allogreffe de cellules souches. L'étude comprend une phase rétrospective. L'étude nécessite que les échantillons de sang périphérique du patient soient prélevés :

• en entrant dans le département
• après 1 mois de greffe
• après 3, 6, 9,12 mois de greffe

Population étudiée

Tous les patients subissant une greffe allogénique dans notre institut sont inclus.

Prélèvement et traitement des échantillons de sang

Chaque échantillon de sang périphérique doit être prélevé dans trois tubes héparinés (jusqu'à 18 ml de SP) et un tube non anticoagulant (6 ml pour un total d'au moins 3 ml de sérum)

Chaque échantillon est traité comme suit :

L'échantillon de sang prélevé sans anticoagulant sera centrifugé pour obtenir du sérum, les aliquotes de sérum sont congelées et conservées à -20 °C. L'analyse immunophénotypique du nombre et de la fonction des cellules mentionnées est effectuée sur des échantillons de PB frais dans les 72 heures suivant le prélèvement.

Les cellules mononucléaires et les monocytes sont purifiés par des procédures standard (MNC par centrifugation en gradient de densité, monocytes par sélection immunomagnétique) puis stockés dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation pour les tests fonctionnels attendus. La fraction CD14 négative est congelée et utilisée comme source de lymphocytes T.

Analyse par cytométrie en flux

Le nombre et le phénotype des cellules circulantes du système immunitaire sont déterminés par cytométrie en flux à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques. On considère les cellules immunitaires suivantes :

• Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ dont les lymphocytes T naïfs (CD45RA+CCR7+) les lymphocytes mémoire « effecteurs » (CD45RA-CCR7-), les lymphocytes mémoire « centraux » (CD45RA-CCR7+) et les lymphocytes effecteurs (CD45RA-CCR7+).
• Lymphocytes T régulateurs (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +).
• Lymphocytes B (CD19 +)
• Cellules NK (CD56+CD16-) et cellules cytotoxiques (CD56+CD16+).
• Cellules dendritiques myéloïdes CD11c+ (lignée-, DR+, CD33+), Cellules dendritiques plasmacytoïdes (lignée-, DR+, CD33- et CD123+) et DC monocytoïdes (CD33+, CD14-, CD16+).
• Inflammatoires (CD14+CD16+) et Constituants (CD14+CD16-) Monocytes

Etudes fonctionnelles sur monocytes purifiés

• La production de TNF alpha et d'IL12 est mesurée en cytométrie de flux.
• La fonction allostimulatrice est déterminée dans des cultures leucocytaires mixtes en utilisant HLA différents lymphocytes T CD4+ comme « répondeurs ».
• La capacité à capturer des antigènes est mesurée en cytométrie en flux sur des cellules individuelles par des antigènes de fluorescence, tels que l'albumine conjuguée au FITC ou des billes fluorescentes.
• Le profil d'expression génique est réalisé à l'aide d'une étude MICROARRAY

Etudes fonctionnelles sur lymphocytes T purifiés

• L'expression des molécules d'activation, de différenciation et d'apoptose est déterminée par cytométrie
• La production de cytokines est déterminée en cytométrie en flux monochrome après stimulation avec des anti-CD3 et des anti-CD28.
• Chez les patients mâles positifs HLA-A2 recevant une greffe de donneur femelle, la fréquence des lymphocytes T anti-HY est mesurée par des pentamères conjugués au fluorochrome.
• Chez tous les autres patients, la réponse du donneur de lymphocytes T aux antigènes récepteurs est mesurée par ELISPOT.

Étude des cytokines sériques

La concentration des cytokines sériques est déterminée en cytométrie par CBA (Cytokine Bead Assay, CBA, Becton Dickinson, Mountian View, CA, USA). Nous analysons les cytokines suivantes :

• Cytokines T-helper 1 : TNF-alpha, IFN-gamma et IL-12 ;
• T-helper 2 et cytokines régulatrices (IL-10, IL-5) et TGF-bêta
• Chimiokines : MCP1, MCP2, RANTES, MIP1-alpha et MIP1-bêta ; IL-8, IP-10.

Étude des auto-anticorps sériques

La concentration des anticorps antinucléaires est mesurée par immunofluorescence indirecte sur des cellules HEp2 (une lignée cellulaire d'hépatocarcinome). Les anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires extractibles (ENA) sont mesurés par ELISA (ENA SCRENING). En cas de positivité, la présence d'anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques est déterminée par DOT BLOT.

étude PCR micro(mi)ARN dans le sérum et les cellules du patient

L'ARN total est extrait d'échantillons de sérum humain et conservé à -80°C. Une partie de l'ARN (3µl) est traitée pour transcription inverse et pré-amplification avec un pool d'amorces selon la description du fournisseur. 664 miARN humains, 6 petits ARN humains et 1 miARN contrôle sont traités en parallèle.

Profil d'expression génique Etude des monocytes de patients greffés par PCR et MICROARRAY

L'ARN messager des monocytes est extrait des cellules, converti en ADNc par la transcriptase inverse et en même temps marqué avec une sonde fluorescente. L'hybridation entre les acides nucléiques (sondes) présents sur la matrice et l'ADNc cible restera hybridée et pourra alors être identifiée en détectant l'endroit où elle se lie. A la fin de l'étude, tous les échantillons seront détruits.

Traitements concomitants

Les patients recevront ou ont reçu une chimiothérapie pour la préparation de la greffe conformément à la pratique clinique actuelle. Après la transplantation, les patients recevront des médicaments pour la prophylaxie de la GVHD et des infections conformément à la pratique clinique. Les thérapies concomitantes éventuellement administrées selon la pratique clinique sont documentées dans le CRF.

Calendrier des visites et des évaluations

La visite du patient est prévue et le CRF est terminé lors de l'inscription. Il y a 6 prélèvements sanguins par patient. Tout prélèvement sanguin après l'inscription peut être retardé ou anticipé de 14 jours

Tests de laboratoire

Les tests sont effectués dans le cadre du parcours de soins normal et ne sont pas spécifiques à une étude. Les informations sur les examens sanguins sont rapportées sur les CRF.

analyses statistiques

Le critère d'évaluation principal de l'étude est la mesure du nombre de cellules immunitaires circulantes dans le PB avant et après la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques. L'analyse statistique consiste en une analyse de comparaison entre les moyennes à l'aide du programme GRAPH PAD PRISM version 4.02. Le niveau de signification est défini comme <0,05 L'analyse des paramètres secondaires est effectuée en utilisant les mêmes méthodes.

Taille de l'échantillon

L'étude est proposée à tous les patients subissant une greffe allogénique. Le nombre de greffes réalisées à l'Institut Seràgnoli est en moyenne de 50 à 60 par an. On estime donc que 300 patients seront enrôlés dans l'étude.

Procédures administratives

Toute modification au protocole sera faite sous la forme de l'avenant. Aucun autre type de modification du protocole n'est autorisé pendant la période d'étude. Tout changement inattendu dans l'étude sera consigné dans le rapport d'étude clinique.

Gestion du consentement éclairé

Tous les patients datent et rédigent le consentement éclairé dans le cadre d'une des visites prévues par le parcours de soins normal. Pour les patients décédés, il est considéré que le traitement des données est autorisé avec l'approbation de l'étude par le comité d'éthique, conformément à l'autorisation générale (Journal officiel 72 du 26/03/2012)

Archives documentaires

L'investigateur principal est responsable du stockage des documents essentiels de l'étude avant, pendant et après l'achèvement ou la fin de l'étude, conformément aux délais requis par les lois applicables et les BPC.

Les données collectées dans le CRF sont strictement anonymes et le sujet n'est identifié que par un numéro et des initiales.

L'investigateur devra conserver les données originales du patient et son consentement écrit éclairé.

Contrôles / Audits

Si une Autorité de Régulation exige une inspection, l'Enquêteur doit en informer immédiatement le Comité d'Éthique.

Publication des résultats

Les résultats de l'expérience seront publiés dans les douze mois suivant la conclusion.