Effetti della caffeina sul rapporto EEG Theta/Beta e sul controllo cognitivo

BACKGROUND E OBIETTIVI DELLA RICERCA

Il controllo cognitivo è una parte essenziale del funzionamento cognitivo, poiché consente il controllo dall'alto verso il basso, guidato dall'obiettivo, sui processi automatici guidati dallo stimolo. La corteccia prefrontale (PFC) del cervello svolge probabilmente un ruolo importante in molti aspetti del controllo cognitivo, tra cui l'attenzione guidata dagli obiettivi, la memoria di lavoro e la regolazione delle emozioni. Precedenti studi EEG che esaminavano il controllo cognitivo hanno identificato un potenziale marcatore elettrofisiologico per il controllo cognitivo mediato da PFC. Questi studi hanno scoperto che il rapporto tra le oscillazioni cerebrali theta e beta misurate dall'EEG è elevato nei bambini con ADHD (che generalmente sperimentano uno scarso controllo cognitivo) e in adulti non selezionati con scarso controllo dell'attenzione. Si ritiene che questo rapporto theta/beta (TBR) rifletta la misura in cui l'attività cerebrale prefrontale esibisce un controllo regolatorio su più aree cerebrali posteriori e sottocorticali, il che ha reso questa misura utile nella diagnosi e nel trattamento di disturbi correlati a uno scarso controllo cognitivo come ADHD.

Nel presente studio, i ricercatori propongono un nuovo metodo per convalidare ulteriormente la TBR come marcatore elettrofisiologico per il controllo cognitivo, somministrando caffeina ai partecipanti. La caffeina è ampiamente nota per migliorare vari aspetti del controllo cognitivo, che dovrebbe andare di pari passo con una diminuzione del TBR.

È importante sottolineare che il controllo cognitivo beneficia sia del mantenimento di rappresentazioni rilevanti per il compito sia dell'aggiornamento flessibile di queste rappresentazioni. Queste funzioni di controllo cognitivo possono fare affidamento su aree del cervello alquanto diverse. Vale a dire, mentre il mantenimento delle rappresentazioni rilevanti per il compito può dipendere maggiormente dal funzionamento della PFC, l'aggiornamento flessibile di queste rappresentazioni può basarsi maggiormente sull'attività dopaminergica nello striato. Il rapporto theta/beta come marcatore dell'attività PFC può quindi riflettere in modo specifico il mantenimento delle informazioni rilevanti per l'attività e il contrasto di questa misura EEG con una misura dell'attività della dopamina striatale può far luce sulla natura della TBR. Nel presente studio, i ricercatori lo faranno misurando i tassi di ammiccamento spontaneo (EBR), che hanno dimostrato di essere sensibili all'attività striatale dopaminergica.

Il primo obiettivo del presente studio sarà quello di convalidare ulteriormente il rapporto theta/beta (TBR) come marcatore elettrofisiologico per il controllo cognitivo mediato da PFC somministrando caffeina a partecipanti sani. I ricercatori si aspettano che (1a) il rapporto theta/beta sarà inversamente correlato alle prestazioni del controllo cognitivo (focalizzazione dell'attenzione, spostamento dell'attenzione, memoria di lavoro; misurato con TACT e N-back; forse principalmente correlato alle prestazioni del focus TACT), (1b) caffeina aumenterà le prestazioni di controllo cognitivo, (1c) la caffeina ridurrà il rapporto theta/beta e che (1d) questi effetti benefici della caffeina sulle prestazioni cognitive saranno mediati da questa diminuzione del rapporto theta/beta.

Il secondo obiettivo di questo studio sarà esaminare se TBR ed EBR moderino in modo differenziale gli effetti della caffeina sul controllo cognitivo. Vale a dire, poiché queste misure probabilmente riflettono l'attività di diverse aree cerebrali, possono prevedere effetti differenziali (possibilmente a forma di U invertita) della caffeina a seconda della loro attività di base. Ad esempio, l'aumento della dopamina striatale attraverso il consumo di caffeina può essere vantaggioso solo quando l'attività dopaminergica striatale iniziale (come evidenziato dall'EBR basale) non è troppo alta in primo luogo, perché quando lo è, ciò può quindi tradursi in un aumento della distraibilità, piuttosto piuttosto che una migliore flessibilità cognitiva. Pertanto, i ricercatori si aspettano che (2a) il TBR al basale moderi gli effetti della caffeina sulle prestazioni del controllo cognitivo (forse principalmente le prestazioni del focus TACT) e che (2b) l'EBR al basale moderi gli effetti della caffeina sul funzionamento del controllo cognitivo (forse principalmente prestazioni di cambio TACT).

Il terzo obiettivo del presente studio sarà esaminare gli effetti della caffeina sull'elaborazione emotiva e il ruolo della TBR in questo. È importante sottolineare che si ritiene tradizionalmente che la caffeina aumenti l'elaborazione e l'ansia legate alla minaccia, specialmente a dosi più elevate. Tuttavia, un numero crescente di studi sugli animali sta dimostrando che piccole dosi di caffeina possono effettivamente essere ansiolitiche. In parte, ciò può essere dovuto a un aumento delle capacità di controllo cognitivo e attenzionale. Vale a dire, sebbene la relazione sia complessa, ansia e controllo dell'attenzione si influenzano a vicenda. L'ansia può aumentare la vigilanza per l'elaborazione correlata alle minacce, mentre le capacità di controllo dell'attenzione possono proteggere da questo. Una dose ottimale di caffeina potrebbe teoricamente aumentare il controllo dell'attenzione nella misura in cui ciò riduce l'eccessiva elaborazione delle informazioni relative alle minacce. Tuttavia, gli effetti dose-dipendenti della dopamina, della noradrenalina e della caffeina prevedono che questo dosaggio ottimale dipenda dai livelli basali di questi trasmettitori e quindi probabilmente dall'ansia che è associata all'aumento dell'attività della dopamina e della noradrenalina. La potenziale utilità di dosi moderate di caffeina come farmaco profilattico per (sintomi attentivi dell'ansia) può quindi dipendere in modo critico da una tale possibile influenza moderatrice dell'ansia. Nel presente studio, i ricercatori hanno esaminato questa relazione prendendo in considerazione gli effetti moderatori dell'ansia di tratto negli effetti della caffeina sull'elaborazione emotiva. I ricercatori si aspettano che (3a) un TBR più elevato sarà correlato a una maggiore interferenza sull'EST, (3b) una dose moderata di caffeina ridurrà l'interferenza emotiva sull'EST, (3c) gli effetti della caffeina sull'interferenza emotiva saranno mediati da un cambiamento nella TBR e che (3d) gli effetti della caffeina sull'interferenza emotiva saranno moderati dalle differenze individuali nell'ansia di tratto.

L'ansia di tratto sarà misurata tramite self-report utilizzando lo STAI-t, che verrà aggiunto come covariata nelle analisi in cui viene esaminata la relazione tra TBR e AC. Infine, in questo studio i ricercatori esploreranno molti altri possibili fattori di confusione nella relazione tra consumo di caffeina e controllo cognitivo, comprese le misure di autovalutazione del controllo dell'attenzione di tratto e stato, ansia, sonnolenza e sintomi di ADHD.

PROGETTAZIONE DI STUDIO

Uno studio incrociato, randomizzato, controllato con placebo, in doppio cieco. Dopo una prima sessione di formazione, i partecipanti visiteranno il laboratorio due volte, separati da circa una settimana. In queste due sessioni di laboratorio, i partecipanti consumeranno per via orale una capsula contenente 200 mg di caffeina pura (una quantità simile di caffeina si trova in circa 2 tazze di caffè) e una capsula contenente una sostanza di riempimento placebo (somministrazione randomizzata e in doppio cieco). L'accecamento e la randomizzazione dell'assegnazione delle capsule saranno effettuati dalla farmacia del Leiden University Medical Center (LUMC).

PARTECIPANTI

Quaranta donne volontarie sane (di età compresa tra 18 e 26 anni) parteciperanno a questo studio. I partecipanti saranno abbastanza ingenui al consumo di caffeina (bevendo ≤100 mg di caffeina, o circa una tazza di caffè, al giorno) e verrà chiesto di astenersi dal consumo di caffeina e alcol per 12 ore prima dell'inizio delle sessioni di laboratorio. I partecipanti saranno studenti reclutati presso l'Università di Leida attraverso vari annunci (ad esempio, presso il campus universitario). I partecipanti che si sono ritirati dallo studio, quando possibile, saranno sostituiti da un altro partecipante selezionato a caso. Per tali partecipanti sostitutivi, il farmacista LUMC ha preparato capsule in cieco contenenti placebo e caffeina nello stesso ordine del partecipante originale che stanno sostituendo.

PROCEDURE

Dopo le procedure di screening online, i partecipanti idonei saranno testati contemporaneamente in tre giorni separati. Le sessioni di test si svolgeranno tra le 10:00 e le 17:00, della durata di circa 2 ore per sessione. Ai partecipanti verrà chiesto di astenersi dal consumo di alcol e caffeina per 12 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Il primo giorno di test (formazione), i partecipanti completeranno questionari che valutano dati demografici, livelli di tratto del controllo dell'attenzione (ACS), livelli di ansia di tratto (sottoscala tratto STAI), sonnolenza abituale (ESS) e sintomi ADHD (ADHD Rating Scale-IV) . Inoltre, verranno misurati l'EEG a riposo (8 minuti in blocchi alternati di 1 minuto ad occhi aperti/chiusi) e l'EBR spontaneo (un blocco ad occhi aperti di 4 minuti). Inoltre, i partecipanti acquisiranno familiarità con i compiti cognitivi (TACT; N-Back; EST). I partecipanti completeranno queste misure per ridurre la novità o gli effetti di apprendimento nelle successive sessioni di test. In ogni giorno di test, verranno somministrati questionari sullo stato (sonnolenza attuale, KSS; controllo dell'attenzione, VAS; e ansia, sottoscala dello stato STAI) tra ogni misurazione basale di 4 minuti (EBR) e 8 minuti (EEG) e alla fine della giornata (cioè, somministrato due volte il primo giorno di allenamento e tre volte il giorno 2/3 giorni di consumo).

Il secondo giorno di test sarà circa una settimana dopo il primo giorno di test. Prima del consumo di capsule, verranno misurati EEG ed EBR. I partecipanti riceveranno quindi una capsula contenente caffeina (200 mg) o placebo (somministrazione randomizzata in doppio cieco). Dopo una pausa di 30 minuti (poiché la caffeina impiega circa mezz'ora per diventare attiva), l'EBR e l'EEG verranno nuovamente misurati. Infine, i partecipanti completeranno gli stessi compiti cognitivi che hanno completato il primo giorno.

Il terzo giorno di test verrà ripetuto il protocollo di test del secondo giorno, con l'eccezione che verrà somministrata l'altra capsula rimanente di caffeina (200 mg) o placebo.

COMPITI DI CONTROLLO COGNITIVO

Tutti i compiti cognitivi (TACT; N-Back; Emotional Stroop Task) sono programmati e completati su un computer utilizzando E-Prime (v2.0). I compiti di controllo cognitivo sono descritti di seguito.

1. Compito di controllo dell'attenzione a due fattori (TACT): il TACT è un compito di congruenza globale/locale che mira a misurare la focalizzazione e lo spostamento dell'attenzione. In questo compito, ai partecipanti viene mostrata una grande freccia composta da diverse frecce più piccole che puntano nella stessa direzione (congruente) o opposta (incongruente). I partecipanti sono istruiti a rispondere alla direzione della freccia grande o delle frecce più piccole il più velocemente possibile senza commettere troppi errori. Possono farlo premendo il tasto freccia sinistra o destra su una tastiera, usando l'indice e il medio della mano dominante. Prima della comparsa di una freccia, i partecipanti vedono uno schermo grigio per 500 ms, dopodiché appare per 500 ms la parola "Grande" di colore blu o "Piccola" di colore giallo, che indica a quale freccia devono rispondere i partecipanti. Dopo una schermata grigia di 250 ms, la freccia appare al centro dello schermo, che scompare dopo 2000 ms o quando viene data una risposta. In ogni prova, la freccia appare in una posizione leggermente diversa per garantire che i partecipanti guardino la freccia piuttosto che fissare alcuni pixel sullo schermo (che in teoria potrebbero essere sufficienti per identificare la direzione delle frecce).

   Nella parte focalizzata sull'attenzione del compito, i partecipanti completano due blocchi di 52 prove ciascuno. In un blocco i partecipanti rispondono solo alla direzione della freccia grande, e nell'altro blocco i partecipanti rispondono solo alla direzione delle frecce più piccole. La performance TACT focus viene misurata sottraendo gli RT su prove congruenti (cioè, prove in cui non è necessaria l'inibizione della distrazione delle frecce non assistite) da RT su prove incongruenti (cioè, prove in cui i partecipanti devono inibire la loro risposta alla distrazione di frecce non assistite). Pertanto, differenze minori negli RT indicano migliori prestazioni di messa a fuoco. Nella parte di spostamento dell'attenzione del compito, i partecipanti completano due blocchi di 120 prove, separati da una pausa di un minuto, in cui la direzione della freccia a cui i partecipanti devono rispondere cambia ogni sei prove (cioè, 40 turni in totale) . Le prestazioni dello spostamento TACT vengono calcolate sottraendo gli RT nelle ultime due prove prima di uno spostamento dell'attenzione dagli RT nelle prime due prove dopo uno spostamento dell'attenzione (ovvero, le prove in cui i partecipanti hanno spostato la loro attenzione dal guardare frecce più grandi a frecce più piccole o viceversa). Pertanto, differenze minori negli RT indicano migliori prestazioni di cambiata. Le due prove prima e dopo un turno sono sempre incongruenti per aumentare la difficoltà (e quindi probabilmente i costi del turno) di questo compito. L'ordine dei blocchi di messa a fuoco (ovvero, prima la freccia grande o le frecce più piccole) e l'ordine del primo completamento dei blocchi di messa a fuoco o spostamento, sono controbilanciati rispetto ai partecipanti. Le prove in cui i partecipanti danno risposte errate, o risposte improbabilmente lente o veloci, non vengono ulteriormente analizzate.

2. Attività N-Back: L'attività N-back è un'attività che valuta diversi processi di memoria di lavoro. Nell'attività N-Back, ai partecipanti vengono mostrate in sequenza le lettere. I partecipanti devono indicare se la lettera corrente corrisponde alla lettera mostrata n posti prima, utilizzando 1 ("stessa lettera") o 2 ("lettera diversa") su una tastiera. Sono state somministrate le attività 1-back e 3-back, poiché la caffeina ha probabilmente la maggiore influenza sulle prestazioni delle attività 3-back e potrebbe non influenzare in modo molto diverso le prestazioni delle attività 1-back e 2-back. Per ogni condizione n-back, vengono mostrate in totale 75 lettere, di cui 25 (33%) sono hit (cioè, prove che sono state mostrate n posti indietro). Le prime tre prove di ogni blocco non sono mai bersagli. Ogni lettera viene visualizzata per 500 ms, seguita da uno schermo vuoto di 1500 ms. I partecipanti possono rispondere alla lettera in questo intero intervallo di 2000 ms. Prima di ogni condizione n-back, i partecipanti ricevono istruzioni ed esempi del compito (sotto la supervisione del ricercatore nel giorno della formazione) e completano 21 prove di formazione (7 prove di successo), per assicurarsi di aver compreso il compito. L'ordine di completamento 1-back e 3-back sarà controbilanciato rispetto ai partecipanti. Le prestazioni vengono misurate esaminando i punteggi di accuratezza (% corretto) e esaminando gli RT su prove con risposta corretta.
3. Emotional Stroop Task (EST): L'EST è una variante del tradizionale Stroop task (in cui i partecipanti devono nominare il colore di una parola stampata con un nome di colore diverso, ad es. denominare il colore della parola "Rosso" scritta con inchiostro blu). Nell'EST vengono mostrate immagini cariche di emozioni, alle quali è sovrapposto un quadrato colorato. I partecipanti devono rispondere al colore del quadrato e come tale devono inibire l'influenza distraente delle immagini. Le immagini vengono scelte dal database IAPS e vengono selezionate in base al loro equilibrio e alle valutazioni di eccitazione per rappresentare tre condizioni dell'immagine: neutra, negativa e positiva. Per ciascuna condizione dell'immagine, 4 immagini (ogni volta con il quadrato in una posizione diversa: in alto o in basso x sinistra o destra) vengono mostrate 8 volte (ovvero 32 prove per condizione, 96 prove in totale). Il colore del quadrato viene scelto casualmente tra tre possibili opzioni (rosso, giallo o blu) in ogni prova. Durante ogni prova, prima viene mostrata un'immagine per 200 ms, dopo di che un quadrato colorato viene sovrapposto a questa immagine in una delle quattro posizioni possibili. I partecipanti hanno quindi 1800 ms per rispondere al colore del quadrato, cosa che possono fare utilizzando i pulsanti colorati di una casella di risposta standard. Quindi, viene mostrata una schermata grigia di 2000 ms, dopodiché appare l'immagine successiva. Prima dell'attività vera e propria, il partecipante completa 24 prove pratiche in cui vengono mostrate immagini neutre. Le prestazioni nell'Emotional Stroop Task vengono misurate esaminando gli RT nelle prove di condizione negativa e positiva, rispetto agli RT nelle prove di condizione neutra, nelle prove con risposta corretta.

QUESTIONARI

Tutti i questionari sui tratti (ACS; STAI-t; ADHD Rating Scale-IV; ESS) sono programmati e completati su un computer utilizzando E-Prime (v2.0). I questionari statali (STAI-s; VAS AC-s; KSS) vengono completati utilizzando carta e penna. I questionari sono descritti di seguito.

1. Scala di controllo dell'attenzione (ACS): ai partecipanti verrà somministrata una traduzione olandese modificata dell'ACS. L'ACS mira a misurare il controllo dell'attenzione dei tratti, come valutato con 20 affermazioni che misurano lo spostamento dell'attenzione (ad esempio, "Posso passare rapidamente da un compito all'altro"), il focus dell'attenzione (ad esempio, "La mia concentrazione è buona anche se c'è musica nel stanza intorno a me") e pensiero flessibile (ad esempio, "Ho difficoltà a trovare rapidamente nuove idee"). I partecipanti devono indicare fino a che punto le affermazioni riflettono il loro controllo dell'attenzione su una scala a 4 punti, da 1 ("quasi mai") ​​a 4 ("sempre").
2. Indice di ansia dei tratti di stato (sottoscala dei tratti; STAI-t): la scala dei tratti dello STAI olandese è composta da 20 elementi che misurano l'ansia dei tratti (ad esempio, "Mi preoccupo troppo per qualcosa che in realtà non ha importanza"). I partecipanti possono rispondere a questi item utilizzando una scala di valutazione a 4 punti, che va da 1 ("quasi mai") ​​a 4 ("quasi sempre").
3. Scala di valutazione ADHD-IV: ai partecipanti verrà somministrata una traduzione olandese modificata della scala di valutazione ADHD-IV. Questo questionario è composto da 23 item che misurano i sintomi dell'ADHD di iperattività/impulsività (ad esempio, "mi sento irrequieto") e disattenzione (ad esempio, "sono rapidamente distratto"). Ai partecipanti viene chiesto di valutare la misura in cui l'item si è applicato a loro negli ultimi 6 mesi, su una scala da 0 ("Mai o raramente") a 3 ("Molto spesso").
4. Epworth Sleepiness Scale (ESS): L'ESS viene utilizzato come misura della sonnolenza abituale. Sull'ESS, ai partecipanti viene chiesto di valutare quanto è probabile che si appisolino in otto situazioni abituali e recenti (ad esempio, "Mentre guardano la televisione"), utilizzando una scala da 0 ("Non si assopicerebbe mai") ​​a 3 ( "Alta possibilità di sonnecchiare").
5. Indice di ansia dei tratti di stato (sottoscala statale; STAI-s): la scala statale dello STAI olandese è composta da 20 elementi che misurano quanto i partecipanti si sentano ansiosi in questo momento (ad esempio, "Mi sento calmo", "Sono preoccupato"). I partecipanti possono rispondere a questi elementi utilizzando una scala di valutazione a 4 punti, che va da 1 ("Per niente") a 4 ("Molto").
6. Karolinska Sleepiness Scale (KSS): Il KSS è un VAS a 9 punti che valuta la sonnolenza soggettiva e istantanea. Ai partecipanti viene chiesto di segnalare quanto sono vigili o assonnati su una scala da 1 ("Molto vigile") a 9 ("Molto assonnato (sonno da combattimento)").
7. VAS AC-s: la scala di controllo dell'attenzione VAS è composta da sei elementi che valutano le attuali sensazioni di controllo dell'attenzione dei partecipanti (ad es. "Ho difficoltà a concentrarmi"). I partecipanti devono indicare fino a che punto l'oggetto riflette il loro attuale controllo dell'attenzione contrassegnando linee di 100 mm, ancorate con "Per niente" e "Molto" sui lati sinistro e destro.

MISURAZIONE EBR ED EEG

1. Tassi di ammiccamento spontaneo (EBR): l'EBR spontaneo sarà raccolto in 4 min. blocco occhi aperti utilizzando EOG verticale, che registra le differenze di tensione tra due elettrodi posti sopra e sotto l'occhio. In questi 4 min. intervallo, ai partecipanti verrà chiesto di guardare un punto centrale nella stanza in uno stato rilassato. L'EBR individuale sarà calcolato dividendo il numero totale di ammiccamenti durante i 4 min. intervallo di 4.
2. EEG spontaneo: l'EEG spontaneo verrà registrato per 8 min. continuamente in blocchi alternati di 1 minuto di registrazione occhi aperti/occhi chiusi. Le registrazioni EEG saranno acquisite attraverso il cuoio capelluto utilizzando 16 elettrodi, posizionati secondo il sistema internazionale 10/20, utilizzando il sistema ActiveTwo BioSemi. Gli elettrodi saranno posizionati sui mastoidi sinistro e destro per il riferimento offline dei segnali del cuoio capelluto alla media dei segnali mastoidei. Per misurare i movimenti degli occhi e delle palpebre, gli elettrodi dell'elettrooculogramma (EOG) saranno posizionati sopra e sotto l'occhio sinistro (EOG verticale) e il canto esterno di ciascun occhio (EOG orizzontale). L'elaborazione dei dati offline verrà eseguita in Brain Vision Analyzer V2.02. Verranno applicati un filtro passa-alto da 0,1 Hz, un filtro passa-basso da 100 Hz e un filtro notch da 50 Hz. I dati saranno analizzati in segmenti di quattro secondi. I dati verranno corretti automaticamente per artefatti oculari e i segmenti contenenti artefatti rimanenti verranno rimossi. Verrà applicata una rapida trasformazione di Fourier (con una risoluzione di 0,25 Hz, utilizzando una finestra di hamming del 10%) per calcolare la densità di potenza dell'area per le bande di frequenza beta (13-30 Hz) e theta (4-7 Hz). Le densità di potenza per i tre elettrodi frontali saranno mediate in misure per la densità di potenza frontale beta e frontale theta, e utilizzate per calcolare i rapporti theta/beta, che saranno log-trasformati in caso di non normalità.

ELABORAZIONE DATI

La rimozione dei valori anomali per ogni attività cognitiva verrà eseguita su base trial-to-trial (escludendo le risposte improbabilmente veloci e/o lente) per ciascun partecipante. Per prima cosa verrà applicata una rimozione approssimativa di RT, dopodiché verrà condotta una rimozione più sofisticata delle prove periferiche. Sulla base di studi precedenti con questi compiti, le seguenti prove verranno rimosse:

1. TACT: prove più veloci di 200 ms o più lente di 1200 ms, dopodiché le prove completate più velocemente o più lentamente di 2,5 SD dell'RT medio per quell'attività verranno rimosse.
2. N-Back: le prove più veloci di 300 ms verranno rimosse.
3. EST: prove più veloci di 300 ms o più lente di 1200 ms, dopodiché le prove completate più velocemente o più lentamente di 2,5 SD dell'RT medio per quell'attività verranno rimosse.

Ci sono alcune prove della stabilità di TBR ed EBR nel tempo, il che è conforme all'idea che questi marcatori riflettano processi neurali stabili, simili a tratti. Tuttavia, l'influenza delle circostanze dipendenti dallo stato su queste misure non è ancora del tutto chiara. Nel presente studio, il TBR e l'EBR di base verranno misurati in ogni giorno di test, ma solo uno di questi valori di base TBR e EBR verrà utilizzato come marcatore neurale simile a un tratto nelle analisi di moderazione. La selezione di quale di queste misure di riferimento verrà utilizzata nelle analisi di moderazione si basa sulle seguenti regole:

1. Se gli investigatori scoprono che le misure di base TBR o EBR al giorno 1 sono molto simili (confronto medio e/o correlazione) alle corrispondenti misure di base al giorno 2 e al giorno 3, le misure di base del giorno 1 verranno utilizzate nelle analisi di moderazione.
2. Se gli investigatori scoprono che le misure di base TBR o EBR al giorno 1 differiscono notevolmente dalle corrispondenti misure di base al giorno 2 o al giorno 3, le misure di base del giorno 1 verranno utilizzate nelle analisi di moderazione.
3. Se gli investigatori scoprono che le misure di base TBR o EBR al giorno 1, giorno 2 e giorno 3 differiscono notevolmente l'una dall'altra, le misure di base del giorno 1 verranno utilizzate nelle analisi di moderazione.
4. Se gli investigatori scoprono che le misure di base TBR o EBR del giorno 2 e del giorno 3 sono molto simili, ma differiscono notevolmente dalle corrispondenti misure di base del giorno 1, le misure di base medie del giorno 2 e del giorno 3 verranno utilizzate nelle analisi di moderazione.