Costruzione e validazione clinica di un modello predittivo per la terapia adiuvante postoperatoria nel carcinoma epatocellulare basato su immagini patologiche digitali Whole-Slide e deep learning

# I. Contesto e Obiettivi dello Studio Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore maligno comune in tutto il mondo, al 6° posto per incidenza e al 3° per mortalità a livello globale. Causa circa 480.000 decessi ogni anno, con la Cina che rappresenta oltre il 45% dei casi globali, rappresentando un carico di malattia estremamente pesante 1. La resezione chirurgica radicale è il mezzo principale per i pazienti con tumore al fegato in stadio iniziale per ottenere una sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, il tasso di recidiva postoperatoria a 5 anni è elevato fino al 50%-70%, il che limita gravemente la prognosi del paziente 2. La terapia adiuvante postoperatoria è diventata una strategia chiave per ritardare la recidiva e migliorare la sopravvivenza. Tra queste terapie, la chemioembolizzazione transarteriosa (TACE) e gli inibitori della tirosin-chinasi (TKI, come sorafenib e lenvatinib) sono stati ampiamente utilizzati nel trattamento di pazienti ad alto rischio di recidiva 1,3.

La TACE induce necrosi ischemica embolizzando localmente i vasi sanguigni che alimentano il tumore combinata con la perfusione di farmaci chemioterapici, ed è adatta per il tumore al fegato in stadio intermedio 4,5. I farmaci TKI multitarget, d'altra parte, possono inibire sistematicamente vie di segnalazione come il recettore del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGFR) e il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR), esercitando effetti anti-angiogenici e anti-proliferazione tumorale, e sono diventati il trattamento standard per il tumore al fegato avanzato 3. Tuttavia, entrambe le modalità di trattamento hanno limitazioni significative: il tasso di risposta obiettiva della TACE è solitamente solo del 50%-60%, e alcuni pazienti non possono trarne beneficio e potrebbero persino subire danni alla funzionalità epatica 6. Sebbene i TKI possano estendere la sopravvivenza libera da recidiva (RFS) dei pazienti postoperatori ad alto rischio di 3-5 mesi, il tasso di risposta al trattamento in popolazioni non selezionate è inferiore al 20%, e l'incidenza di reazioni avverse di grado 3-4 (come ipertensione, reazione cutanea mani-piedi e proteinuria) è superiore al 50%, portando all'interruzione del trattamento nel 20% dei pazienti a causa dell'intolleranza agli effetti collaterali tossici 3,7,8. Attualmente, la clinica manca di un sistema di biomarcatori efficiente e affidabile per identificare le popolazioni potenzialmente beneficiarie. Di conseguenza, le decisioni terapeutiche si basano ancora sull'esperienza clinica (ad esempio, basandosi su caratteristiche patologiche tradizionali come dimensioni del tumore e invasione vascolare), risultando in una limitata individualizzazione, spreco di risorse mediche e ulteriore carico di trattamento per i pazienti.

Studi recenti hanno dimostrato che il microambiente immunitario tumorale (TIME) è una base biologica chiave che influenza la sensibilità terapeutica della TACE e dei TKI 3. Le caratteristiche compositive del TIME, inclusa l'infiltrazione di cellule immunitarie (come cellule T CD8⁺, Treg, CTL e macrofagi associati al tumore di tipo M2), l'espressione di molecole di checkpoint immunitario (come il ligando 1 della morte cellulare programmata, PD-L1) e la struttura spaziale, sono strettamente correlate alla risposta al trattamento 9-12. Ad esempio, un TIME immuno-infiammatorio (alta densità di cellule T CD8⁺ e formazione di strutture linfoidi terziarie) potrebbe essere positivamente correlato con la necrosi tumorale dopo TACE e la risposta al trattamento con TKI; al contrario, un fenotipo immune-esente o desertico spesso indica resistenza al trattamento 13-15. Tuttavia, l'attuale valutazione del TIME si basa principalmente su tecnologie ad alta risoluzione come l'immunoistochimica multipla (mIHC) e la trascrittomica spaziale. Sebbene questi metodi possano descrivere il microambiente in dettaglio, presentano colli di bottiglia applicativi come alto costo, operazione complessa, elevati requisiti per la qualità del campione e bassa standardizzazione, che ne limitano la promozione clinica.

Le innovazioni nell'intelligenza artificiale, in particolare la tecnologia di apprendimento profondo, hanno fornito un nuovo approccio per estrarre informazioni patologiche approfondite dalle immagini di interi vetrini (WSI) colorate con ematossilina ed eosina (HE) convenzionali. Come dato di routine per la diagnosi patologica postoperatoria (ogni paziente con HCC avrà WSI colorate HE generate dopo l'intervento senza campionamento o test aggiuntivi), le WSI contengono dettagli morfologici cellulari e della struttura tissutale che si sono dimostrati in grado di mappare le caratteristiche fondamentali del TIME. Ad esempio, attraverso architetture come la rete neurale convoluzionale (CNN) e il Vision Transformer (ViT), è possibile identificare automaticamente modelli morfologici correlati alla densità di infiltrazione delle cellule T CD8⁺ e all'espressione di PD-L1, consentendo la previsione cross-modale di "morfologia HE → stato immunitario" 16,17. Gli studi più recenti hanno confermato che i modelli di apprendimento profondo basati su WSI-HE possono predire l'instabilità dei microsatelliti (MSI) nel cancro del colon-retto con alta accuratezza (AUC 0,88) 18, l'espressione di PD-L1 (AUC 0,80) e il carico mutazionale tumorale (TMB, AUC 0,91) nel cancro del polmone non a piccole cellule 19,20. Nel campo del tumore al fegato, studi hanno anche utilizzato l'apprendimento profondo su WSI per predire il rischio di recidiva postoperatoria (AUC 0,82) e l'infiltrazione di cellule immunitarie nei tessuti del tumore al fegato (AUC 0,78) 21,22. Tuttavia, nessuno studio si è concentrato sul punto critico clinico di "predire l'efficacia della terapia adiuvante postoperatoria (TACE/TKI)", e manca una validazione clinica multicentrica con campioni di grandi dimensioni.

Pertanto, la costruzione di un modello predittivo per la terapia adiuvante postoperatoria dell'HCC basato su WSI colorate HE e algoritmi di apprendimento profondo non solo aiuta ad analizzare il ruolo meccanicistico del TIME nella risposta al trattamento, ma supera anche le limitazioni delle tecnologie di rilevamento esistenti come alto costo, ciclo lungo e dipendenza da piattaforme speciali, promuovendo lo sviluppo delle decisioni sulla terapia adiuvante per il tumore al fegato verso precisione e accessibilità. Questo progetto intende integrare dati clinicopatologici multicentrici con algoritmi di intelligenza artificiale per stabilire un modello patologico digitale adatto a predire l'efficacia di TACE e TKI, e condurre una rigorosa validazione clinica, con l'obiettivo di fornire uno strumento decisionale scientifico e affidabile per la selezione del trattamento postoperatorio dell'HCC.

# II. Procedure Specifiche e Flusso di Lavoro Questo studio è una ricerca completa che combina studi diagnostici e interventistici, suddivisa in due parti principali e più fasi. Il suo scopo è sviluppare e validare un sistema predittivo basato sull'intelligenza artificiale per la terapia adiuvante postoperatoria del carcinoma epatocellulare (HCC). Lo studio complessivo segue il processo standardizzato per lo sviluppo di software come dispositivo medico (SaMD) basato sull'intelligenza artificiale (AI), inclusa la raccolta retrospettiva di dati, lo sviluppo e l'addestramento del modello, la validazione retrospettiva, la validazione osservazionale prospettica e lo studio interventistico prospettico finale.

• Parte 1: Costruzione e Validazione del Modello di Riconoscimento del Microambiente Tumorale

  • Fase di Sviluppo e Addestramento Verranno utilizzati set di dati pubblici (ad esempio, The Cancer Genome Atlas, TCGA) e un set di dati retrospettivo del centro di ricerca (n=1500, con 400 casi già raccolti) come set di addestramento. Il compito principale di questa fase è sviluppare un modello di apprendimento profondo (ad esempio, un'architettura basata su Vision Transformer o ResNet) per identificare, segmentare e quantificare automaticamente le caratteristiche chiave del microambiente tumorale dalle immagini di interi vetrini (WSI) colorate con ematossilina ed eosina (HE). Queste caratteristiche includono, ma non sono limitate a, il grado di infiltrazione di cellule immunitarie, la proporzione stromale, l'invasione vascolare e le aree necrotiche. Tutte le immagini saranno annotate in modo indipendente e in cieco da almeno due patologi senior. Le discrepanze saranno risolte attraverso consenso o arbitrato da un terzo patologo senior per formare lo standard di riferimento.
  • Fase di Validazione Esterna Un set di dati WSI retrospettivo da 8-10 centri medici cooperativi nazionali sarà utilizzato per condurre una validazione preliminare della capacità di generalizzazione del modello. Questa fase mira a valutare la robustezza del modello con diverse apparecchiature di scansione, diversi processi di preparazione e colorazione dei vetrini e diverse abitudini di interpretazione dei patologi.
• Parte 2: Costruzione del Modello di Previsione della Risposta al Trattamento e Validazione Clinica Multilivello

Questa parte è il nucleo dello studio. Mira a costruire un modello di classificazione che possa predire la risposta dei pazienti a diversi regimi di trattamento adiuvante postoperatorio (solo chirurgia, chirurgia + TACE, chirurgia + TACE + TKI) basandosi sull'output del modello nella Parte 1 (cioè, le caratteristiche quantificate del microambiente tumorale) combinato con variabili cliniche necessarie (come stadio TNM, classificazione della funzionalità epatica Child-Pugh e livello di AFP). Questa parte adotta una strategia di validazione gerarchica rigorosa:

• Fase di Addestramento del Modello Verranno utilizzati dati retrospettivi del centro di ricerca (n=1500). I pazienti inclusi devono soddisfare i seguenti criteri: ① HCC confermato patologicamente; ② sottoposti a resezione radicale; ③ avere dati completi sulla terapia adiuvante postoperatoria e sul follow-up. Definizione della risposta al trattamento: l'endpoint primario è la sopravvivenza libera da recidiva (RFS), e gli endpoint secondari includono la sopravvivenza globale (OS) e il tasso di risposta obiettiva (ORR). L'addestramento sarà condotto utilizzando algoritmi di apprendimento automatico multi-classe (come alberi di potenziamento del gradiente e reti neurali profonde) per produrre la categoria del regime di trattamento da cui il paziente ha più probabilità di beneficiare.
• Fase di Validazione Interna Un set di validazione indipendente (n≈500, non sovrapposto al set di addestramento) sarà riservato dai dati del centro attraverso divisione casuale. Sarà utilizzato per valutare inizialmente le prestazioni discriminative del modello e per eseguire l'ottimizzazione degli iperparametri per prevenire l'overfitting.
• Fase di Validazione Esterna 1 (Validazione Retrospettiva e Calibrazione del Modello) Verranno raccolti dati retrospettivi da più centri in tutto il paese (8-10 centri, n=3000). Gli scopi principali di questa fase sono: ① validare le prestazioni del modello su un set di dati esterno su larga scala e più eterogeneo; ② calibrare o condurre un'ottimizzazione iterativa limitata del modello basandosi sui risultati della validazione per formare il modello predittivo finale definitivo.

Fase di Validazione Esterna 2 (Validazione Retrospettiva su Larga Scala) Il modello definitivo sarà utilizzato per la validazione su un nuovo set di dati retrospettivo su scala ultra-ampia (n=10.000) (da 3-5 centri). Questo consolidherà ulteriormente il livello di evidenza e fornirà una base solida per gli studi prospettici.

Fase di Validazione Esterna 3 (Studio Osservazionale Prospettico) Un totale di 1000 pazienti con HCC postoperatorio idonei saranno arruolati prospetticamente e consecutivamente in 10-15 centri. Le loro immagini WSI saranno raccolte e inserite nel modello per ottenere il regime di trattamento previsto. Tuttavia, questa fase dello studio non interferirà con le decisioni cliniche effettive. I ricercatori registreranno i risultati di previsione del modello e le decisioni cliniche effettive, e osserveranno la prognosi effettiva dei pazienti attraverso il follow-up per valutare la coerenza tra le previsioni del modello e i risultati effettivi, nonché l'attenuazione delle prestazioni del modello in contesti reali.

### Fase di Validazione Esterna 4 (Studio Interventistico Prospettico) Questo è il passo di validazione finale dello studio. Sarà condotto uno studio clinico prospettico, randomizzato controllato o pragmatico in collaborazione con 3-5 centri, con circa 600 pazienti arruolati. I pazienti saranno divisi casualmente in due gruppi: ① Gruppo Decisione Assistita dal Modello: i clinici svilupperanno piani di trattamento per i pazienti basandosi sul regime di trattamento ottimale previsto dal modello; ② Gruppo Trattamento Standard: i piani di trattamento saranno sviluppati interamente dai clinici basandosi sulle linee guida esistenti e sull'esperienza clinica. Il confronto primario sarà la RFS tra i due gruppi, in modo da fornire il più alto livello di medicina basata sull'evidenza per dimostrare l'utilità clinica della decisione assistita dal modello e il suo valore nel migliorare la prognosi.