心脏移植后的冠状动脉疾病 (ECP)

背景

第一部分：

心脏移植 (HTX) 是终末期心力衰竭的一种极好的治疗方法，平均生存期约为 15.6 年 (1)。 长期生存仍然是一个挑战。 随着免疫抑制治疗的改进，急性细胞排斥反应 (ACR) 的发生率有所下降，但在术后第一年之后，死亡的主要原因之一是心脏同种异体移植血管病变 (CAV)，它是冠状动脉疾病的一种加速形式 (2 ).

ACR 是一种公认​​的现象，但抗体介导的排斥反应 (AMR) 的诊断已获得认可。 AMR 与更大的移植物功能障碍、CAV 的发展和死亡率有关。 诊断基于临床、组织病理学、免疫病理学和通过固相分析鉴定供体特异性抗体 (3,4)。 然而，AMR 在临床上通常是无症状的，组织病理学和免疫病理学评估可能与观察者之间的显着差异有关。 鉴定供体特异性抗体 (DSA) 似乎更合适。 在 Graft 研究中，我们发现大约 25% 的 HTX 患者的 DSA 水平显着升高。 他们有亚临床移植物功能下降、先前的 ACR 负担和 CAV 患病率较高。

指南建议对 DSA 进行常规评估，但治疗 DSA 且无病理发现的患者的证据不足。

体外光分离疗法 (ECP) 使淋巴细胞失活并减少细胞心肌浸润和 DSA 的产生。 尽管 ACR 和 AMR 的治疗结果看起来很有希望，但 ECP 仅限于少数几个中心 (3,5,6)。

本研究的目的是评估 ECP 对 CAV 的影响。

第二部分：

HTx 后 CAV 的原因尚不清楚。 CAV 是在心外膜和心肌内动脉中发展的动脉内膜弥漫性进行性增厚。 光学相干断层扫描 (OCT) 和虚拟组织学血管内超声 (IVUS) 显示大约 50% 的患者 (7) 存在多层斑块，这可能代表血管内血栓形成 (7,8)。 尸检研究证实冠状动脉血栓的患病率很高 (63-83%) (9)。 血小板是血栓形成的细胞介质，但在免疫系统中也起着重要作用。 以前的研究表明，血小板参与急性移植物排斥反应中的血管炎症和免疫细胞运输。 血小板配体诱导结合位点 1 (LIBS-1) 抗体结合与 HTX 患者的 CAV 进展相关 (10)。 因此，血小板可能在 CAV 进展中发挥重要作用。 需要进一步的研究来阐明血小板功能与冠状动脉血栓之间的关系，以及阿司匹林对 HTX 患者血小板功能的影响。

这部分研究的目的是评估血小板功能与腔内血栓存在之间的关系，以及腔内血栓与血凝块形成和变性之间的关系。

血小板功能和血块形成：

缺血性心脏病是由动脉粥样硬化引起的。 动脉粥样硬化斑块的破裂导致血小板和凝血系统激活，最终导致血栓形成。 IVUS (7) 和 OCT (8) 最近的报告揭示了复合层状斑块的高患病率，这可能代表有组织的血栓。

冠状动脉血流速度储备：

冠状动脉血流速度储备 (CFVR) 代表冠状动脉循环在心肌代谢需求增加后扩张的能力。 CFVR 定义为腺苷输注下的最大流量/充血流量与心外膜冠状动脉中静息血流速度的比率 (14)。

CFVR 值为 2 可区分显着冠状动脉狭窄与非显着冠状动脉狭窄。

学习规划

在 Skejby AUH 心脏病科对所有 CAV 和 DSA 患者进行了对照前瞻性研究。 根据我们的计算，样本量为 30 名患者。 将包括 30 名没有 DSA 的 HTX 患者的移植物年龄匹配组作为对照。

方法

在年度例行检查之前筛选患者是否有资格被纳入，并获得知情同意。 奥胡斯大学医院心脏病科在静息和运动期间进行 CAG、OCT 和高级超声心动图检查，包括基线和 12 个月随访时的冠状动脉血流储备 (CFR) 测量。 34 毫升血液将储存在生物库中。 每天用 75 毫克阿司匹林治疗 7 天前后的血样。

如果通过 Luminex 分析 DSA 水平 >3000 MFI，患者将在奥胡斯大学医院免疫学系接受 ECP 治疗。

血小板功能：

使用 Multiplate® Analyzer 通过全血血小板聚集测定法进行评估。 该仪器基于阻抗聚集法，其中血小板聚集水平通过两个电极之间的阻抗变化来反映。 花生四烯酸（ASPI 测试）、TRAP-6 和二磷酸腺苷（ADP 测试）用作激动剂以诱导血小板聚集。 为了验证阿司匹林的依从性，将测量血清血栓素 B2 水平。

使用自动流式细胞术 (Sysmex XN 9000) 评估血小板周转参数。 测量血小板计数、未成熟血小板分数和计数、平均血小板体积、血小板分布宽度和血小板大细胞比。

冠状动脉造影 (CAG)：

HTx 后，经验丰富的操作员将根据常规协议执行 CAG。 CAV 的程度将根据 ISHLT 指南以盲法量化：

• CAV 0：无狭窄/不规则
• CAV 1：
• CAV 2：>70% 的主要分支或 >50% 的左主干具有正常的舒张移植功能
• CAV 3：>70% 的主要分支或 >50% 的左主干具有受损的舒张移植功能。

光学相干断层扫描 (OCT)：

根据制造商的建议并根据部门标准操作程序，在 CAG 期间使用 Terumo Lunawave 系统在所有三个主要冠状动脉中进行 OCT 采集。 使用 QCU-CMS 软件（Leiden University Medical Center, NL）以盲法进行分析。 在没有高级斑块形态的区域进行定量内膜组织分析。 获得的部分中的所有斑块根据管腔呈现进行表征和确定大小，并映射以进行连续评估。 巨噬细胞浸润被量化为炎症的标志。 分层复杂斑块被定义为内膜中具有分层结构的异质信号。

根据复杂分层斑块的 CAV 范围，将患者分为三组：

• 0%
• 0-7%
• >7%

经胸超声心动图：

将记录以下参数：2D 射血分数、局部室壁运动评分（17 节段模型）、左心室舒张末期容积 (LVEDV) 和收缩期容积 (LVESV)、左心房容积、二尖瓣环和 LV 应变的组织多普勒研究以及应变率。 此外，舒张功能将通过早期舒张心肌速度、E/A 比率、EdecT、等容弛豫时间 (IVRT) 和 E/e' 比率进行评估。 全球纵向应变 (GLS) 将通过优化帧速率（50-90 帧/秒）的顶端四腔、两腔和长轴视图的二维图像进行评估。

组织多普勒超声心动图的冠状动脉血流储备 (CFR)：

远端 LAD 是本地化的，在基础条件下和在腺苷输注（充血）期间以 140 µg/kg/min 的速度使用 6 MHz 探头测量多普勒流速。

运动协议：

我们将通过心肺运动试验（CPX）测量峰值耗氧量。 患者将使用 GE Healthcare eBike L 测力计（Wauwatosa，WI 53226 U.S.A.）进行多阶段症状限制的半仰卧自行车测力计运动测试。 工作负载从 0 W 开始，每 3 分钟增加 25 W。 将鼓励患者锻炼直到筋疲力尽（Borg >18）。 将在基线和每 3 分钟测量一次肱动脉血压，直到达到最大工作量。

经济合作伙伴：

1. 通过单采术收集单核细胞
2. 向细胞中加入 8-甲氧基补骨脂素 (8-MOP)，然后进行紫外线 A (UVA) 照射
3. 再输注处理过的细胞。

连续 2 天使用 cMNC 或 MNC 软件（TerumoBCT，美国科罗拉多州莱克伍德）通过 Spectra Optia 收集单核细胞。 使用 MNC，执行两个腔室收集（21 + 4 mL），提供 50 mL 的固定产品体积。 对于 MNC，收集最好以 1 ml/min 的速度进行，直到产品体积达到 75 mL。 Hct 是在取自 Spectra Optia 套件样品管的样品上测量的。 产品用 250 ml NaCl 稀释至最终体积为 300 ml。 产品袋与照明袋无菌连接，并向产品中添加 3 mL 8-MOP（Macopharma，Tourcoing，France）。 照明在 Macogenic G2 (Macopharma, Tourcoing, Fr​​ance) 中进行。 添加 8-MOP 前的 Hct 不应超过 2%。 通过使用血库 IT 系统（Prosang、Databyrån、瑞典斯德哥尔摩）和 ISBT128 标签来维护文档和可追溯性。

样本量计算 - 血小板功能

>根据健康志愿者的数据计算样本量

主要结果是有和没有 CAV 的 HTx 患者与健康志愿者之间血小板聚集的差异。 没有出版物报告 HTx 患者的血小板聚集，但从之前的研究中我们知道，使用花生四烯酸 (AA) 作为激动剂时，健康未用药个体的平均血小板聚集为 1004 聚集单位 x 分钟，标准差为 163 聚集单位 x 分钟（ASPI-测试）。 选择 150 个聚集单位 x 分钟的最小相关差异、5% 的显着性水平（双侧 alpha）和 90% (1-β) 的统计功效，我们必须在每组中包括 25 名患者。

>根据使用阿司匹林的稳定 CAD 患者的数据计算样本量

主要结果是有和没有 CAV 的 HTx 患者与稳定 CAD 患者之间血小板聚集的差异。 从之前的研究中我们知道，使用 AA 作为激动剂（ASPI 测试），接受阿司匹林治疗的稳定型冠状动脉疾病患者的平均血小板聚集为 324 聚集单位 x 分钟，标准差为 80 聚集单位 x 分钟。 选择 70 个聚合单位 x 分钟的最小相关差异、5% 的显着性水平（双侧 alpha）和 90% (1-β) 的统计功效，我们必须在每组中包括 28 名患者。

统计数据

根据通过 OCT 评估的 CAV 严重程度（0%、0-7% og >7% 复杂层状斑块）将患者分为三组。 比较各组之间的血小板功能。 正态分布的变量将表示为平均值±标准差。 如果不满足正态性假设，将执行非参数统计和适当的对数转换。 组间差异将在适当时通过方差分析 (ANOVA) 或 Kruskal-Wallis 人口平等等级检验进行检验。 双尾 p 值为

观点 通过结合心脏病学系和生物化学系研究单位的高级分析和专家知识，将获得有关 HTx 患者血小板功能和 ECP 治疗的新知识。 潜在地，ECP 治疗和抑制血小板的药物治疗可能会减少 CAV 的发展，从而改善全世界 HTx 患者的生活质量和长期预后。