对严重呼吸系统疾病的回顾性研究以获取 COVID-19 的存在 (Explore)

A- 回顾性研究采用的方法：

样本量确定：

2019 年 11 月至 2020 年 2 月提交的 500 个案例将被纳入 Ain shams 大学医院的探索研究

样本采集：

SARI 住院患者的口咽和鼻咽拭子 (NP)：

内科、胸科和儿科医院的临床医生将负责从所有符合世卫组织标准 SARI 病例定义的住院患者中获取口咽和鼻咽拭子用于实验室检测。

口咽拭子：

应使用植有尼龙纤维拭子涂药器的干燥无菌尖端擦拭后咽部。 拭子应放置在标有患者唯一 ID 并含有 2mL 病毒转运介质 (VTM) 的 15 mL 离心管中。 然后切断涂药棒。

鼻咽拭子：

将带有尼龙纤维拭子涂药器的柔性无菌尖端插入鼻孔并返回鼻咽部并在原位放置几秒钟。 然后通过旋转运动缓慢取出。 对于 SARI 患者，将拭子放入与标有患者唯一 ID 的口咽拭子相同的离心管中，并切下轴。 装有拭子的 15 毫升试管应尽快以冷链方式小心运送到医院实验室。

样品处理：

应使用涡流混合器将 15 ml 试管内收到的拭子剧烈搅动 10 秒，使细胞从拭子尖端游离，然后将两根拭子从试管中取出并用镊子丢弃。 VTM 应分成 2 个预先标记的无菌冷冻管，并带有正确的患者 ID。 一个冷冻管应立即放入冰箱 (-70°C)，而另一个冷冻管将用于在 MASRI 分子实验室通过实时 PCR 进行分子检测。

将使用 FTD- 呼吸道 33 试剂盒通过实时多重 PCR 对样本进行检测，以确定是否存在多种呼吸道病原体，包括：甲型流感和甲型流感亚型 Pdm(H1N1) 和季节性 H3、乙型流感、丙型流感、副流感病毒1、2、3 和 4；冠状病毒 NL63、229E、OC43 和 HKU1；人类偏肺病毒 A 和 B；鼻病毒;呼吸道合胞病毒 A 和 B；腺病毒；肠道病毒；副肠孤病毒；博卡病毒；耶氏肺孢子虫；肺炎支原体；肺炎衣原体;肺炎链球菌; B 型流感嗜血杆菌（HIB 检测还可检测与咽炎相关的副溶血性嗜血杆菌）；金黄色葡萄球菌；卡他莫拉氏菌；博德特氏菌属 (副百日咳博德特氏菌除外)、肺炎克雷伯菌；军团菌属和沙门氏菌属。 根据与鸟类或骆驼的接触史，或参考 WHO 的 MERS-CoV 或禽流感疑似病例，疑似感染 MERS-CoV 或 HPAI H5N1 的病例将使用 CDC 方案进行检测。

样品储存：

第二等份样品将储存在 MASRI MOLECULAR 实验室的冰箱（-70°C）中，用于外部质量保证（EQA），通过现场测试随机选择具有不同结果的样品，并由其他 NAMRU-3 实验室专家重新测试在 MASRI 分子实验室；这些样本还可用于通过 NGS 或 MASRI 分子实验室的病毒分离进行进一步检测。

样品转移：

所有样本将保存在医学院Ain Shams研究所-分子单位实验室，不会转移到其他实验室。

B- 使用即用型 RT 实时测试分析探索 COVID-19 的研究测试 - 病毒 RNA 分离：使用由 thermofisher 或其他推荐公司提供的市售试剂盒。 工作将在完全无菌条件下的生物安全 2 级柜中完成。 -

COVID-19 检测：

使用实时逆转录聚合酶链反应 RT-PCR，可以对通过各种方法获得的呼吸道样本进行测试，包括鼻咽拭子或痰液样本。 结果通常在几个小时内可用。 分子方法利用聚合酶链反应 (PCR) 以及核酸测试和其他先进的分析技术，使用实时逆转录聚合酶链反应检测病毒的遗传物质以用于诊断目的。 由 hvd、thermofisher 和其他公司提供的市售套件。

C- covid-19 可能阳性样本的基因组测序 (NGS) Ion Torrent 靶向下一代测序 (NGS) 可简化研究工作流程，以完成 SARS-CoV-2（导致 COVID-19 的冠状病毒）的完整基因组测序和流行病学研究). 通过将一组高度特异性的通用冠状病毒引物与高保真预混液结合使用，所有基因组片段都会被扩增，DNA 扩增子会在任何 Ion Torrent 系统上进行测序，从而在一天之内提供高度准确的冠状病毒分型。 Ion ArnpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel 由 2 个池组成，其扩增子的长度范围为 125275 bp iri 长度，用于完整的病毒基因组测序